UCA1在AML患者骨髓组织单个核细胞中的表达及对AML细胞增殖凋亡调节作用观察

李佳佳，伍燕平，白雪，王蒙，李忠玉，张平平

蚌埠医学院第一附属医院血液科，安徽蚌埠 233003

急性髓系白血病（AML）是一种高异质性的造血系统恶性肿瘤，其特征为髓系增殖祖细胞的增殖分化失控，导致骨髓内未成熟前体细胞异常蓄积、正常成熟血细胞的产生不足［1］。目前，AML患者的预后仍然较差，5年生存期仍小于40%［2-3］。因此，阐明AML发生发展的的基础机制，有助于改善AML的治疗效果。研究［4-5］发现，长链非编码 RNA（lncRNA）在AML的发展中发挥重要的调节作用。LncRNA是一种长度超过200个核苷酸的RNA，通过调控基因表达参与各种生物过程［6］。LncRNA UCA1于2006年被确定为膀胱癌标志物［7］。最新研究［8-11］发现，胃癌、乳腺癌组织中UCA1高表达，且UCA1在恶性肿瘤的发生发展中发挥致癌作用。研究［11］证实，UCA1可抑制人原髓白血病细胞HL60的迁移，促进细胞凋亡［11］。另有研究［12］发现，UCA1敲低可降低儿童AML细胞的化学耐药性，其机制可能为microRNA抑制了糖酵解（miR）-125a /己糖激酶2途径。目前UCA1在AML发生发展中的具体作用机制尚不明确。我们观察了AML患者骨髓组织单个核细胞UCA1的表达变化，同时观察抑制UCA1表达的AML细胞增殖、凋亡情况，并探讨其可能作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人AML细胞株（U937，HL60）购自北纳生物。 RPMI-1640培养基（用于U937；美国HyClone），IMDM培养基（用于HL60；美国Gibco）。培养基中补充10%的胎牛血清和L-谷氨酰胺（2 mmol/L； 美国 Gibco）。Wnt多克隆抗体（1∶300）、兔抗人β-catenin（1∶300）、兔抗人p-gsk-3ß（1∶300），GAPDH（1∶1 000；均购自美国Abcam），二抗（美国Abcam），逆转录试剂盒说明书（Mir-XTM miRNAFirst-Strand Synthesis Kit， TAKARA），UCA1-siRNA（抑制UCA1表达）和对照空载siRNA（上海GenePharma构建），Lipofectamine™2000（美国Invitrogen）；MTT试剂盒（美国Sigma）；PCR试剂盒（GeneCopoeia， Rockville， MD， USA）；SYBR premix试剂盒（Takara）；微量离心机（美国Thermo Scientific） ；紫外分光光度仪（ 美国贝克曼，Du.640） ；细胞培养箱（中国力康）； 酶标仪（美国Awareness） ；荧光定量PCR仪（ 7500型，美国ABI）； 凝胶成像分析扫描仪（美国Bio-Rad）；显微镜（日本尼康公司）；流式细胞仪（美国Bio-Rad）。

1.2 AML患者骨髓组织单个核细胞UCA1检测方法

1.2.1 临床资料 收集2019年5月—12月间于蚌埠医学院第一附属医院血液科就诊的初诊AML患者30例作为实验组、门诊缺铁性贫血患者30例作为对照组。初诊AML患者中男16例、女14例，年龄25～82（59.93 ± 15.35）岁；染色体正常核型22例，染色体异常核型8例；存在基因突变患者18例，其中CEBPA基因突变3例、TET2基因突变4例、NPM1基因突变6例、FLT3基因突变5例。本研究经我院伦理委员会批准同意，纳入者或其家属签署知情同意书。

1.2.2 AML及缺铁性贫血患者骨髓组织单个核细胞UCA1检测 AML及缺铁性贫血患者均留取骨髓标本，提取单个核细胞，-80 ℃保存。采用RT-PCR法检测AML及缺铁性贫血患者骨髓组织单个核细胞UCA1。TRIzol提取总RNA，取RNA样品1 μL，测定纯度和浓度。将得到的RNA逆转录为cDNA，RT-PCR测量各组U937和HL60细胞中UCA1，PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60 ℃ 60 ℃ s，共42个循环。以GAPDH为内参，UCA1上游引物5'-CACTCTTTGCCAGCCTCAGCTT-3'，下游引物 5'-AGGTGTGAGTGGCGGTCTGAAT-3'；GAPDH 上游引物5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，下游引物 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。以 2-ΔΔCt代表UCA1相对表达量，重复检测3次，取平均值。

1.3 抑制UCA1表达的U937、HL60细胞增殖凋亡情况观察

1.3.1 细胞分组及UCA1-siRNA转染方法 取生长良好的U937、HL60细胞接种于6孔板，1×105/孔，待细胞生长至70%以上融合时进行后续转染。将U937及HL60细胞各分为1、2、3组。1、2组分别用UCA1-siRNA和空载siRNA转染，使用Lipofectamine™2000转染试剂盒，所有操作均严格按照说明书进行。3组为空白对照，不作任何处理。转染后将各组细胞置于37 ℃培养箱中继续培养48 h。转染48 h取各组细胞，RT-PCR法检测各组UCA1，确定UCA1转染效率。U937细胞1、2、3组UCA1相对表达量分别为 1.00 ± 0.06、1.00 ± 0.09、1.00 ± 0.08，HL-60细胞 1、2、3 组 UCA1 相对表达量分别为 0.38 ±0.04、1.00 ± 0.01、1.00 ± 0.01，与 2、3 组比较，U937及HL-60细胞1组UCA1相对表达量低（P均＜0.05），提示UCA1-siRNA转染成功。

1.3.2 各组细胞增殖情况观察 采用MTT法。分别于转染 24、48、72 h取各组细胞，接种于96孔板，调整细胞密度为100 μL细胞悬液中含1 × 104个细胞。每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，孵育4 h后离心弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光振荡15 min，用酶标仪检测各组490 nm波长处的光密度OD值。以OD值代表各组细胞的增殖活力，每组实验重复3次，取平均值。

1.3.3 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。转染48 h时取各组细胞，冷PBS洗涤2次后将细胞重悬于100 μL的Binding Buffer，分别加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL的 PI，室温避光染色10 min，用流式细胞仪测算1、2组的细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.3.4 各组细胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3ß蛋白检测 采用WESTERN Blotting法。转染48 h时取各组细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，12 000 r/min离心15 min，取上清液相同条件再次离心15 min，BCA法测定上清液中蛋白。制备电泳凝胶，经电泳、转膜、封闭，加入一抗：兔抗人Wnt多克隆抗体（1∶300）、兔抗人β-catenin多克隆抗体（1∶300）、兔抗人p-gsk-3ß（1∶300）过夜孵育，以β-actin为内参，加入二抗（1∶3 000）孵育2 h，加入ECL发光液，于暗室曝光、显影液中显影、定影液中定影，采用Quantity One软件分析条带亮度，Wnt、β-catenin、p-gsk-3ß蛋白相对表达量以其蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。实验重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。采用P-P图检验数据的正态性，符合正态分布的计量数据以表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AML及缺铁性贫血患者骨髓组织单个核细胞UCA1相对表达量比较 AML及缺铁性贫血患者骨髓组织单个核细胞UCA1相对表达量分别为4.96 ±1.51、1.09 ± 0.93，二者比较，P＜0.05。

2.2 转染24、48、72 h时各组细胞OD值比较 转染24、48、72 h时各组细胞OD值见表1。与2、3组比较，转染24、48、72 h时U937及HL-60 1组细胞增殖活力低（P均＜0.05）。

表1 转染24、48、72 h时各组OD值（）

表1 转染24、48、72 h时各组OD值（）

组别OD值U937 1组U937 2组U937 3组HL-60 1组HL-60 2组HL-60 3组转染24 h 0.32 ± 0.05 0.36 ± 0.04 0.42 ± 0.02 0.37 ± 0.05 0.45 ± 0.01 0.34 ± 0.74转染48 h 0.48 ± 0.41 0.52 ± 0.07 0.59 ± 0.14 0.47 ± 0.02 0.67 ± 0.21 0.54 ± 0.05转染72 h 0.61 ± 0.88 0.73 ± 0.14 0.71 ± 0.54 0.51 ± 0.08 0.79 ± 0.18 0.68 ± 0.75

2.3 转染48 h时各组细胞凋亡率比较 U937细胞1、2、3组细胞凋亡率分别为 34.20% ± 1.21%、7.21 % ± 1.41%、6.84% ± 1.53%，HL-60细胞1、2、3组细胞凋亡率分别为34.21% ± 1.83%、7.20% ±1.56%、7.85% ± 1.93%，与2、3组比较，U937及HL-60细胞1组细胞凋亡率高（P均＜0.05）。

2.4 各组细胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3ß相对表达量比较 各组细胞Wnt、β-catenin及p-gsk-3ß相对表达量见表2。与2、3组比较，U937及HL-60 1组Wnt、β-catenin相对表达量降低，p-gsk-3ß蛋白相对表达量升高（P均＜0.05）。

表2 各组细胞Wnt、β-catenin、p-gsk-3ß相对表达量（）

表2 各组细胞Wnt、β-catenin、p-gsk-3ß相对表达量（）

组别U937 1组U937 2组U937 3组HL-60 1组HL-60 2组HL-60 3组Wnt 46.18 ± 0，21 89.78 ± 0.38 92.92 ± 0.43 51.14 ± 0.23 77.19 ± 0.37 86.47 ± 0.59 β-catenin 40.11 ± 0.21 60.23 ± 0.32 78.18 ± 0.59 33.76 ± 0.18 80.35 ± 0.35 96.52 ± 0.44 p-gsk-3ß 102.63 ± 0.49 56.83 ± 0.24 60.23 ± 0，17 128.37 ± 0.40 45.96 ± 0.22 52.09 ± 0.35

3 讨论

AML是一种具有高度异质性的造血系统恶性肿瘤，其特征是髓系祖细胞增殖失控，导致未成熟前体细胞在骨髓中异常增殖积聚，而正常成熟血细胞生成不足。尽管 AML随着新药及造血干细胞移植技术的发展，治疗疗效有了显着改善，但AML患者总体预后仍然很差，5年总生存率仍低于40%。因此，AML 发病的内在潜在机制需要进一步研究及阐明，有助于提高及改善AML的治疗效果。最新的国内外研究发现LncRNA可能在在AML的发生发展中发挥着重要的调节作用。

LncRNA是细胞内一类转录本长于200 nt 的不具有开放阅读框的RNA分子，可与多种生物学元件如DNA、RNA和蛋白质相互作用。越来越多的研究认为，LncRNA 在肿瘤发生发展中够起至关重要的作用。LncRNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA，调节基因表达并参与多种生物过程［13］。GAN等［14］发现，lncRNA 锌指反义 1 （ZFAS1） 的沉默抑制了 AML 细胞的增殖并促进了细胞凋亡，并抑制了体内AML 异种移植物的生长。有研究［15］表明，在AML患者中发现新型lncRNA-H22954，其在AML中低表达，且可以通过调节Bcl-2活性抑制 AML细胞生长。lncRNA HOXA 簇反义 RNA2 （HOXA-AS2）先前已被证明在几种人类恶性肿瘤中具有致癌特性［16］。 HOXA-AS2 可 通 过 调 控 HOXA3/EGFR/Ras/Raf/MEK信号通路降低急性淋巴细胞白血病患者的糖皮质激素敏感性。研究［17］共纳入241例AML患者的样本，后发现高HOTAIRM1 水平与更短无白血病生存期、更短 OS 和更高累积复发率相关。

LncRNA UCA1位于染色体19p13.12正链上，具有三个外显子、两个内含子及多个终止密码子，没有任何保守的长开放阅读框 （ORF）。UCA1 的三种转录亚型为 lncRNA UCA1、lncRNA UCA1a及 lncRNA CUDR，大小分别为1.4、2.2和2.7 kb。LncRNA UCA1 是膀胱癌、乳腺癌和肝细胞癌等多种恶性肿瘤中最常见的UCA1亚型，已被明确为多种恶性肿瘤的致癌基因［18-20］。亚细胞定位结果发现，lncRNA UCA1 主要位于细胞质中，可与成熟的RNA 或蛋白质相互作用。膀胱癌患者的血液和尿液样本中也可以检测到lncRNA UCA1，因此认为LncRNA UCA1可能作为膀胱癌具有临床价值的循环肿瘤标志物。尿液样本中lncRNA UCA1的检测是诊断膀胱癌的一种有效且无创的方式，与常规的细胞学方法相结合具有高度灵敏度 （100%） 和特异度（67%） ，并在肿瘤生长和转移中具有致癌作用，因此在许多癌症（包括肝癌、食管癌和胃癌）中作为潜在的生物标志物和治疗靶标［21］。UCA1 作为子宫内膜癌患者不良预后的预测因子，干扰 UCA1 表达能抑制子宫内膜癌细胞的迁移［22］。在前列腺癌中，UCA1 可以作为竞争性内源RNA，通过竞争性结合 miR-221-3P 抑制 EIF4G1的表达［23］。UCA1可能通过靶向吸附 miR-107来影响胰腺癌的进展［24］。在白血病中，UCA1有助于包括AML在内的白血病的化学耐药性［12］。此外，UCA1通过抑制细胞增殖，迁移和侵袭，同时促进人类急性髓性白血病细胞株K562和HL60的细胞凋亡［12］。在当前的研究中，我们观察到UCA1是在人类AML细胞中高度表达（KG1、U937、THP-1和HL60）以及预期的UCA1抑制U937和HL60细胞的增殖并诱导凋亡。本研究结果发现，抑制UCA1表达可抑制HL60细胞的增殖，促进细胞凋亡。说明UCA1在AML中发挥促癌功能，UCA1可能是AML治疗靶点。本文通过沉默急性髓系白血病细胞中UCA1表达，发现沉默急性髓系白血病细胞中UCA1表达后可以抑制AML细胞增殖、促进细胞凋亡，提示UCA1可能在AML的发展中发挥重要作用，但其在AML中的作用机制尚不明确。

本研究结果发现， UCA1在AML患者骨髓组织单个核细胞中高表达，而在缺铁性贫血患者骨髓组织单个核细胞中低表达，说明 UCA1可能促进AML的发展。LIU等［26］共纳入1 240例结直肠癌、食管鳞状细胞癌、前列腺癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤患者进行荟萃分析，结果发现UCA1是癌症患者OS 的独立预后因素。

AML细胞的增殖和凋亡受多种信号通路的调控，Wnt/β-catenin 通路在AML的发生发展中可能发挥重要作用。Wnt/β-catenin 信号转导途径是由最上游的配体WNT启动激活，引发胞质中β-catenin的聚集，β-catenin进入细胞核内与TCF/LEF（T-cell factor/ lymphocyte -enhance-binding-factor）结合，激活下游靶基因的转录。Wnt/β-catenin被认为是干细胞重要的生长因子，在其发育和自我更新中具有重要的调控作用［27］。然而，异常活化的Wnt／β-catenin信号通路可参与调控白血病的发生发展，促进细胞恶性增殖，抵抗细胞凋亡，并提示不良预后［28］。在Wnt/β-catenin信号通路中，p-GSK-3β可以磷酸化其关键信号分子β-catenin，使其易被降解。因此，β-catenin是该信号通路中的负性调控因子。本研究结果显示，沉默LncRNA UCA1表达可降低U937及HL-60细胞中Wnt和β-catenin 蛋白相对表达量，提高p-gsk-3ß蛋白相对表达量。表明沉默LncRNA UCA1可以抑制AML细胞Wnt/β-catenin信号通路激活。推测沉默LncRNA UCA1可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制AML细胞增殖、促进细胞凋亡。

综上所述，UCA1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进AML细胞的增殖、抑制AML细胞凋亡。UCA1有可能作为检测AML的潜在生物标志物。