金环胡蜂蜂房总黄酮提取工艺及抗氧化活性分析

王振吉 杨申明 段德珊 徐文丽 杨依柯

（楚雄师范学院 资源环境与化学学院，楚雄 675000）

蜂房（Nidus vespae），又称露蜂房、马蜂窝、蜂巢等，药用价值较高，具有祛风、杀虫、止痛、抗过敏等功效，民间常用来治疗疮疡肿毒、乳痈、鹅掌风和过敏性体质等病症[1-3]。蜂房中含有酚酸类、黄酮类、萜类及酯类等化合物[4]。研究表明，蜂房具有多种生理活性，在动物生产和饲料工业等领域中具有广泛的应用前景[5-8]。

金环胡蜂（Vespa mandarinia）为膜翅目（Hymenoptera）胡蜂科（Vespidae）胡蜂属（Vespa）中体型最大、性情凶猛捕食性肉食昆虫[9]，其幼虫、全体、蜂毒、蜂房均可入药，药材名大黄蜂子、大黄蜂、蜂巢，主治风湿痹痛，是一种民间中药[10]。目前，大部分金环胡蜂蜂房被丢弃，造成了资源极大浪费。黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性[11,12]，若能从金环胡蜂蜂房中提取黄酮类物质，并用于动物生产和饲料工业领域中，对开发利用金环胡蜂资源具有重要意义。目前，有关VMNTF 的提取及抗氧化性的研究鲜见报道。为此本研究以金环胡蜂蜂房为材料，利用超声辅助酶协同提取VMNTF，通过测定VMNTF 对Fe3+还原能力和·OH、DPPH·的清除能力来评价抗氧化性，旨在为VMNTF 在动物生产和饲料工业等领域中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金环胡蜂蜂房产自云南楚雄，由楚雄师范学院王振吉教授鉴定为金环胡蜂的巢，蜂房烘干（60℃）、粉碎后过40 目筛，得干粉，备用；芦丁标准品（HPLC＞98%），由索莱宝公司生产，其他化学试剂均为AR，由成都金山化学试剂有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 样品溶液的制备

准确称取1.00 g 金环胡蜂蜂房、0.02 g 纤维素酶放入250 mL 锥形瓶中，加入60 mL 体积分数55%乙醇溶液，密封后放入超声波中，在60 ℃的超声波中超声70 min 后，将金环胡蜂蜂房提取液进行抽滤，滤液用体积分数55%乙醇定容至100 mL 容量瓶中，得金环胡蜂蜂房提取液。

1.2.2 VMNTF 成分的鉴定

取5 份2 mL 金环胡蜂蜂房提取液，分别加入质量分数4%NaOH、1%AlCl3-CH3CH2OH、盐酸-镁粉、浓硫酸和质量分数5%FeCl3溶液各1mL 进行反应，检识黄酮类物质的有无[13,14]。

1.2.3 VMNTF 含量测定

以芦丁为标准品，参考文献[15]的方法绘制标准曲线，按式（1）计算总黄酮提取量。

式（1）中：C 为所测VMNTF 的浓度（g.mL-1）；N 为提取液稀释倍数；V 为提取液体积（mL）；M 为金环胡蜂蜂房粉末的质量（g）。

1.2.4 提取工艺单因素试验

选择乙醇体积分数分别为35%、40%、45%、50%、55%的条件下进行提取，液料比30∶1（mL/g），超声温度50 ℃，超声时间60 min，纤维素酶用量2%；确定了乙醇体积分数55%提取VMNTF 效果较好后，在不同超声温度45、50、55、60、65 ℃的条件下提取VMNTF，液料比为30∶1（mL/g），超声时间为60 min，纤维素酶用量为2%；确定了超声温度55 ℃提取VMNTF 效果较好后，在液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）的条件下进行提取，乙醇体积分数55%，超声时间60 min，纤维素酶用量2%；确定了液料比50∶1（mL/g）提取VMNTF 效果较好后，在不同超声时间60、70、80、90、100 min 的条件下提取VMNTF，乙醇体积分数55%，超声温度55 ℃，纤维素酶用量2%，确定不同超声时间的影响。

1.2.5 VMNTF 最佳提取工艺条件优化

以VMNTF 提取量为评价指标，在考察单因素试验的基础上，采用L9(34)试验优化VMNTF 提取工艺条件。试验因素及水平如表1。

表1 正交试验因素水平

1.2.6 VMNTF 提取量测定

准确称取1.00g 蜂房样品5 份，在实验优化后的较佳条件下提取VMNTF，计算VMNTF 平均提取量及相对标准偏差（RSD）。

1.2.7 VMNTF 抗氧化活性测定

将VMNTF 溶液配制为0.01288、0.02576、0.03864、0.05152、0.06440 mg·mL-15 种不同质量浓度，测定其抗氧化性。

（1）VMNTF 对Fe3+还原能力测定

参考文献[16]的方法，稍作修改。取不同质量浓度VMNTF 提取液1.0 mL，加入0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.6）2.0 mL 和质量分数1%铁氢化钾溶液2.0 mL，在50 ℃水浴中恒温20 min，冷至室温后加入2.0 mL 质量分数10%三氯乙酸，离心后取上层清液2.0 mL 加入蒸馏水2.0 mL 和0.5 mL 质量分数0.1%三氯化铁，室温反应10 min 后用超纯水调零，在波长700 nm处测定吸光度值，吸光度值的大小表示样品还原能力的强弱。同时，以同质量浓度药VC 作阳性对照。

（2）VMNTF 对·OH 清除率测定

参考文献[17]的方法，稍作修改。取不同质量浓度VMNTF 提取液2.0 mL，依次分别加入9 mmol/L 硫酸亚铁、9 mol/L 水杨酸-乙醇溶液和9 mmol/L H2O2各2.0 mL，在37 ℃水浴中反应30 min，冷至室温，离心，取上层清液，用蒸馏水调零，在510 nm 处测定吸光度记Ax。用2.0 mL 蒸馏水代替VMNTF 提取液按上述操作测定吸光度记A0。取不同质量浓度VMNTF 提取液2.0 mL，加入6.0 mL 蒸馏水，摇匀，置于37 ℃水浴中恒温30 min，冷至室温，离心，取上层清液，用蒸馏水调零，在510 nm 处测定吸光度记Ax0。同时，以同质量浓度药VC 作阳性对照，·OH 清除率按式（2）计算。

（3）VMNTF 对DPPH·清除率测定

参考文献[18,19]的方法测定不同质量浓度VMNTF对DPPH·清除率，以同质量浓度药VC 作阳性对照，DPPH·清除率按式（3）计算。

式（3）中：Ai为DPPH-乙醇溶液和不同质量浓度VMNTF 提取液吸光度；Ac为DPPH-乙醇与无水乙醇混合溶液吸光度；Ab为无水乙醇与不同质量浓度VMNTF 吸光度。

2 结果与分析

2.1 VMNTF成分的鉴定

金环胡蜂蜂房中黄酮类物质显色反应结果见表2，表明金环胡蜂蜂房提取液中含有黄酮类化合物。

表2 总黄酮成分鉴定表

2.2 芦丁标准曲线

芦丁质量浓度标准曲线见图1，其回归方程为A=10.913C-0.0085（相关系数R2=0.9998），线性范围为0.008～0.04 mg.mL-1。

图1 芦丁标准曲线

2.3 单因素试验结果

乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声时间对VMNTF 提取效果的影响见图2。

2.3.1 乙醇体积分数对VMNTF 提取效果的影响

在液料比30∶1（mL/g）、超声温度50 ℃、超声时间60 min、纤维素酶用量2%条件下，考察乙醇体积分数对VMNTF 提取量的影响，结果见图2A，从图2A 可以看出，在考察的乙醇体积分数35%～75%范围内，VMNTF 的提取量随着乙醇体积分数的增大呈先增大后减小的趋势，乙醇体积分数为55%时，VMNTF提取量最大为15.937 mg·g-1，之后继续增大乙醇体积分数，VMNTF 提取量逐步减小，因此适宜乙醇体积分数在55%附近。

2.3.2 超声温度对VMNTF 提取效果的影响

在乙醇体积分数55%、液料比30∶1（mL/g）、超声时间为60 min、纤维素酶用量为2%的条件下，考察不同超声温度对VMNTF 提取量的影响，结果见图2B，从图2B 可以看出，超声温度在45～65℃时，VMNTF 的提取量随超声提取温度的不断升高呈先增大后减小的趋势，当超声温度升高到55 ℃时，VMNTF提取量达到最大16.125 mg·g-1，之后随着超声温度的升高VMNTF 提取量有减小的趋势，因此适宜超声温度在55 ℃附近。

2.3.3 液料比对VMNTF 提取效果的影响

在乙醇体积分数为55%、超声温度为55 ℃、超声时间为60 min、纤维素酶用量为2%条件下，考察不同液料比对VMNTF 提取效果的影响，结果见图2C，从图2C 可以看出，液料比在30∶1～70∶1（mL/g）时，VMNTF 提取量呈现先增大后减小趋势，在液料比为50∶1 时，VMNTF 提取量达到最大为19.025 mg·g-1，之后随着液料比的增大，VMNTF 提取量逐步减小，因此适宜液料比在50∶1（mL/g）附近。

2.3.4 超声时间对VMNTF 提取效果的影响

在乙醇体积分数55%、超声温度55 ℃、液料比50∶1（mL/g）、纤维素酶用量2%条件下，考察超声时间对VMNTF 提取效果的影响，结果见图2D，从图2D 可以看出，超声时间在50～100 min 时，VMNTF 提取量呈先增大后减小的趋势，在超声时间为80 min 时，VMNTF 提取量达到最大为16.312 mg·g-1，之后随着超声时间的增加，VMNTF 提取量逐步减小，因此适宜超声时间在80 min 附近。

2.4 正交试验结果

结果见表3，从表3 分析可知，不同提取条件对VMNTF 提取量影响程度不同，影响VMNTF 提取量大小顺序依次是超声温度＞液料比＞超声时间＞乙醇体积分数。由极差分析得到较佳VMNTF 提取工艺条件组合为A2B3C3D1，即最佳工艺参数为：乙醇体积分数55%，超声温度60 ℃，液料比60∶1（mL/g），超声时间70 min，纤维素酶用量2%。

表3 正交试验结果

2.5 VMNTF平均提取量测定结果

结果见表4，从表4 可知，VMNTF 平均提取量为20.132 mg·g-1，大于正交试验中VMNTF 最大提取量20.125 mg·g-1，RSD 为0.95%，表明本方法对VMNTF提取量测量准确度较高。

表4 VMNTF平均提取量测定结果

2.6 VMNTF抗氧化活性分析

2.6.1 对Fe3+还原能力的评价

VMNTF 还原能力随质量浓度的变化见图3。由图3 可知，在VMNTF 质量浓度为0.01288～0.06440 mg·mL-1范围内，VMNTF 的还原能力随浓度的增大而增强。当其质量浓度为0.06440 mg·mL-1时，使Fe3+还原产生的吸光度值为1.262，比阳性对照品药维生素C 的还原能力强（吸光度值为0.521），这表明VMNTF对Fe3+具有很强的还原能力。

图3 不同质量浓度VMNTF与VC对Fe3+的还原能力

2.6.2 清除·OH 能力评价

VMNTF 对·OH 清除效果随质量浓度的变化见图4。由图4 可知，VMNTF 质量浓度在0.01288～0.06440 mg·mL-1范围内，清除·OH 的能力随着VMNTF 质量浓度的增大而增强。当VMNTF 质量浓度为0.06440 mg·mL-1时，对·OH 的清除率为94.46%，其清除能力明显大于同质量浓度的阳性对照品药维生素C（清除率为60.49%），这说明VMNTF 具有很强的清除·OH的能力。

图4 不同质量浓度VMNTF与VC对·OH的清除效果

2.6.3 清除DPPH·能力评价

VMNTF 对DPPH·清除效果随质量浓度的变化见图5。由图5 可知，VMNTF 质量浓度在0.01288～0.06440 mg·mL-1范围内，随着VMNTF 质量浓度增大，清除DPPH·能力增强。当VMNTF 质量浓度为0.06440 mg·mL-1时，对DPPH·的清除率为95.02%，其清除能力明显大于同质量浓度的阳性对照品药维生素C（清除率为87.53%），说明VMNTF 具有较强的清除DPPH·的能力。

图5 不同质量浓度VMNTF与VC对DPPH·的清除效果

3 结论

以云南楚雄金环胡蜂蜂房为原材料，VMNTF 得率为评价指标，在单因素实验基础上，结合正交试验分析法优化得到VMNTF 最佳提取工艺为：乙醇体积分数55%、超声温度60 ℃、液料比60∶1（mL/g）、超声时间70 min、纤维素酶用量2%，在此条件下VMNTF平均提取量为20.132 mg·g-1，RSD 为0.95%，该方法适合VMNTF 提取和含量测定。

该研究从Fe3+还原能力、·OH 和DPPH·的清除能力3 个方面来分析VMNTF 的抗氧化性，结果表明：当VMNTF 质量浓度在0.01288～0.06440 mg·mL-1时，对Fe3+还原能力和·OH、DPPH·的清除率均随着VMNTF 质量浓度的增大而增大。当VMNTF 质量浓度为0.06440 mg·mL-1时，使Fe3+还原产生的吸光度为1.262，大于阳性对照品药维生素C 使Fe3+还原产生的吸光度（0.521）；对·OH、DPPH·清除率分别为94.46%和95.02%，均大于阳性对照品药维生素C对·OH（清除率60.49%）、DPPH·（清除率87.53%）的清除率，说明VMNTF 具有较强的抗氧化性，其抗氧化性强于对照品药维生素C。因此，VMNTF 具有开发成为天然抗氧化剂的潜能。