基于代谢组学对延安五倍子蜂蜜特征物筛选的研究

张冯斌 方冲伟 李斌 马玉莲 康科 王鑫 吴黎明

（1 黄龙县养蜂试验站；2 中国农业科学院蜜蜂研究所）

五倍子蜂蜜属于中药蜜的一种，采自漆树科落叶小乔木的五倍子花蜜，未结晶时呈质地浓稠、光泽的琥珀色或深琥珀色，具有五倍子花特有的自然香味，味道有一丝丝苦味和中药材味，作为中药蜜种，五倍子蜂蜜具有调理肠胃、解毒、杀菌和清热去火等作用，备受市场认可，其市场需求量逐年增加。五倍子蜜属于稀有蜜种，产量不及油菜蜜、洋槐蜜和荆条蜜等国内主要蜜种，售价高于普通蜂蜜[1]。

陕西延安地区以独特的地理资源优势，生长有多种蜜源植物，其中就有丰富的五倍子。延安地区的五倍子蜂蜜品质优良，深受消费者青睐。然而，近来一些不良商家受到利益驱使，将与五倍子蜂蜜色泽相近的低价蜂蜜冒充高价的五倍子蜂蜜进行销售，这种“以次充好”的造假方式不仅从外观上很难区分，非五倍子蜂蜜冒充五倍子蜂蜜的现象对延安地区五倍子蜂蜜声誉构成了威胁，并且极大损害了消费者利益。

蜂蜜中酚类化合物总量约有56～500 mg/kg，蜂蜜中这些植物的次级代谢产物不仅赋予其多种活性功能[2]，如抗氧化、抗炎和抗菌等，除此以外，蜂蜜中的酚类化合物也是重要的植物源和地理源标志物。1991年，Ferreres 等9 位学者证明[3]，可以通过鉴定蜂蜜酚酸和黄酮的成分和含量来确定蜂蜜的花源和地理起源。荆条蜜中主要是皂草黄素，槲皮素是向日葵花蜜的特征性成分，没食子酸是石楠花蜜的特征性成分，橙皮素是柑桔蜜中的特征性成分[4]。

本研究主要以延安地区的五倍子蜂蜜为研究对象，通过与多花蜂蜜比较分析其中的酚类化合物，结合多元统计分析筛选出延安地区五倍子蜂蜜的特征化合物，进一步建立特征化合物的准确定量方法，为该地区五倍子蜂蜜的质量控制提供一定的理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验用五倍子蜂蜜、百花蜜，于2021年收集于延安当地蜂场，实验用水为纯净水杭州娃哈哈集团有限公司、甲醇（LC-MS级，美国Merk公司）、乙腈（LC-MS级，美国Merk 公司），水为超纯水（Milli-Q SP Regent Water system，美国）碘（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；碘化钾（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙酸钠、可溶性淀粉（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯）：美国TEDIA公司；氯化钠（分析纯）、乙腈（色谱纯）：北京Dikma 公司；羟甲基糠醛（分析纯）：日本Sigma 公司；果糖、葡萄糖、麦芽糖（分析纯）：Aladdin 公司；蔗糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

美国安捷伦公司6560 系列；超声波清洗机：AS3120A 型，深圳市洁盟清洗设备有限公司；电子天平：FA22048 型，上海精科天美科学仪器有限公司；超纯水系统（Milli-Q Gradient）：美国MILLIPORE 公司；WSTERS2690 超高压液相色谱仪：沃特世公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：苏州岛津仪器有限公司；阿贝折光仪（ARIAS500）：美国REICHERT 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 五倍子蜂蜜理化指标的检测

蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量根据国标GB 5009.8-2016 方法测定[5]：称取混匀后的试样1 g～2 g（精确到0.001 g）于50 mL 容量瓶，加水定容至50 mL，充分摇匀，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，后续滤液用0.45 μm 微孔滤膜过滤或离心获取。上清液过0.45 μm 微孔滤膜至样品瓶，供液相色谱分析[6]。

蜂蜜中的水分根据商检行业推荐性标准SN/T 0852-2012 测定[7]：在测定前先将棱镜擦洗干净，以免留有其他物质影响测定精度。用玻璃棒蘸取混匀的试样1～2 滴，滴于下面的棱镜上，迅速闭合棱镜，静置数秒钟，以待样品达到40℃对准光源，由目镜观察，转动补偿器螺旋，使明暗分界线清晰；转动标尺指针螺旋，使其明暗分界线恰好通过接物镜上十字线的交点。读取标尺上的折光指数，同时核对温度，恰为40℃[8]。

蜂蜜中淀粉酶活性根据国标GB/T 18932.16-2003 测定[9]：淀粉酶活性检测采用GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》规定的方法检测。将配制好的淀粉溶液与处理过的样品溶液充分混匀，在40℃水浴条件下，部分淀粉被蜂蜜溶液中的淀粉酶水解后，剩余淀粉与碘反应产生蓝紫色，随着淀粉酶水解作用，蓝紫色反应逐渐消失，用分光光度计于660 nm 波长处测定吸光度达到0.235 时所需时间，换算出样品中淀粉酶值[10]。

蜂蜜中羟甲基糠醛含量根据国标GB/T 18932.18-2003 测定[11]：称取10 g 试样，精确至0.01 g，置于100 mL 烧杯中，加入10 mL 甲醇，用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解。转移至100 mL 容量瓶中，用水释稀至刻度，充分混匀。用0.45 μm 的滤膜过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定[12]。

1.3.2 蜂蜜酚类化合物分析方法

蜂蜜样品前处理方法：称取5 g 蜂蜜，加5 ml 水，涡旋2 min；加入10 ml 乙腈，涡旋2 min，视情况超声或增加涡旋时间促进结晶蜂蜜的溶解；加入QuEChERs Extract pouch，EN Method 5982-0650（安捷伦内部小包装货号），涡旋2 min；4℃，8000 rpm，离心10 min，取全部上清（8 ml 左右，取一致）；真空旋转蒸发仪35～40℃，2500rpm，旋转蒸发至微干；复溶：用1 mL甲醇复溶，上机[13]。

酚类化合物仪器分析方法：采用安捷伦超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QqQ-MS/MS)对鉴定的标记物进行定量分析[14]。色谱条件：采用双溶剂体系，流动相A 为超纯水，0.1%(v/v)甲酸，流动相B 为乙腈。流速0.3 mL/min，进样量2 μL。梯度洗脱程序每次运行开始在5% B 和B 1 分钟保持在5%，那么B 在2 分钟增加到35%，35%到50%的B 从2 到3 分钟，50%到75%的B 3 到5 分钟，75%到100%的B 从5 到5.1 分钟，并保持在100% B 从5.1 到7 分钟，然后B 7.1分钟下降到5%，保持在5% B 从7.1 到10.0 分钟，发布时间是3 分钟。洗脱液从0 到0.5 分钟转向。柱恒温器保持在40℃。质谱条件：对于质谱分析，质谱数据采集采用多反应监测(MRM)模式，在正电离模式下采集。电喷雾电离(ESI)设置如下：干气温度，200℃；干气流量，15 L/min；喷雾器压力，45 psi；护套气温330℃；鞘气流量，12 L/min；喷嘴电压1.5 kV；毛细管电压，3.5 kV[15]。

1.3.3 数据处理

多元统计分析是用SIMCA 软件实施的。主成分分析（PCA）、聚类分析和正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）是被用来区分五倍子蜂蜜和多花蜂蜜样品。VIP 值1（p＜0.05）的因子是通过OPLS 模型提取出的能显著区分不同蜂蜜样品的因素。

2 结果与分析

2.1 五倍子蜂蜜理化指标分析结果

延安五倍子蜂蜜相关常规理化指标如表1所示，果糖和葡萄糖含量、淀粉酶活性显著优于标准规定指标（P＜0.05），水分远低于相关标准，蔗糖未检出，延安五倍子蜂蜜相关理化指标符合蜂蜜行业标准GH/T18796-2012 的一级品指标[16]。试验所测蜂蜜样品成熟度较高，且品质较好。

表1 五倍子蜂蜜理化指标

2.2 五倍子蜂蜜酚类化合物分析结果

我们首先对所收集的五倍子蜂蜜和多花蜂蜜样品的酚类化合物进行分析。五倍子蜂蜜和多花蜂蜜中的酚类化合物主要有没食子酸、原儿茶醛、4-羟基苯甲酸、杨梅素、咖啡酸、香草酸、桑色素、阿魏酸、木犀草素、槲皮素、短叶松素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、山奈酚、香叶木素、异鼠李素、芒柄花黄素、松属素、毛蕊异黄酮、次黄岑素和柯因等。进一步根据这些蜜样中的酚类化合物分布进行多元统计分析以区分五倍子蜂蜜和多花蜂蜜样品。

主成分分析（PCA）是一种无监督学习算法，它通过将变量投影到具有最大方差的主成分来降低数据的维数，从而达到多元统计分析的目的。它可以作为样品分类前的第一步，揭示变量之间和样本之间的关系，检测异常值。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）是一种有监督的多元统计分析方法，它可以过滤矩阵中的无关变量，最大限度地提高不同样本之间的差异，凸显组间差异[17]。

利用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析基于降维原理简化数据后对数据进行可视化处理，可用于不同品种、不同加工方式等的化学识别及归类。由PCA散点图可知（图1-A），基于酚类化合物的分布可将五倍子蜂蜜样品与百花蜜样品显著区分。进一步，通过OPLS-DA 散点图（图1-B）也清楚显示五倍子蜂蜜及百花蜜样品分别分布于两个不同区域，说明这两类蜂蜜样品酚类化合物组成存在较大差异。聚类分析也将两类蜂蜜有效区分，如图1-C所示。进一步，通过OPLS-DA映射图（图1-D），可以筛选出区分两类蜂蜜样品的重要酚类化合物，图1-C 的峰值和图1-D 的分布看出两样品中特征物的差异，这些主要的差异化合物列在表2中，主要包括16 种化合物。VIP 值越大，表明对五倍子蜂蜜和多花蜂蜜的区分贡献越大。其中筛选出次黄岑素并通过在实际样品中进一步验证，确定在五倍子蜂蜜中其含量远高于多花蜜中的含量，可作为潜在的延安地区五倍子蜂蜜的特征酚类化合物。

图1 基于酚类化合物的多元统计结果

表2 基于OPLS-DA筛选出五倍子蜂蜜和多花蜂蜜的酚类差异化合物

2.3 五倍子蜂蜜中次黄岑素定量分析方法的建立

串联质谱适合对目标化合物进行定量分析。我们拟通过建立UHPLC-MS/MS 方法[18]来准确定量五倍子蜂蜜中的次黄岑素。选取浓度为0.1 mg/L 的次黄岑素标品，用于优化仪器测定条件。首先通过全扫描模式确定283.0 为母离子，合适的碎裂电压为380 V。在10 eV、15 eV、20 eV、25 eV 和30 eV 这些测试的碰撞能量中，20 eV（268.1 m/z）和25 eV（239.8 m/z）产生的子离子丰度最高。

以m/z 268.1 为定量离子，m/z 239.8 为定性离子，次黄岑素的保留时间是5.0 min。将次黄岑素标品逐级稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 绘制标准曲线，获得标准曲线方程为y=0.0006x+25419（R2=0.9993），其中x 和y 分别代表次黄岑素的浓度和峰面积。在0.02～0.50 mg/L 范围内，次黄岑素的标准曲线呈良好的线性关系。在0.05 mg/L 的浓度下，次黄岑素的平均回收率为92.8%～101.2%，且RSD＜2%，表明该方法的准确性和重现性较好。次黄岑素的LOD 和LOQ 分别为5 μg/kg 和20 μg/kg。

基于所建立的UHPLC-MS/MS 方法测定五倍子蜂蜜和多花蜂蜜样品中的次黄岑素的含量。五倍子蜂蜜中次黄岑素的含量范围是30～100 μg/kg，而百花蜜中次黄岑素的含量低于5 μg/kg。我们认为可将次黄岑素作为延安地区五倍子蜂蜜的特征物用于其质量控制。

图2 次黄岑素的串联质谱色谱图

3 结论

为了筛选鉴别延安地区五倍子蜂蜜的特征酚类化合物，我们首先分析了延安地区五倍子蜂蜜和多花蜂蜜中的酚类化合物，结合多元统计方法筛选出次黄岑素可作为延安五倍子蜂蜜的特征酚类化合物，进一步建立了UHPLC-MS/MS方法对蜂蜜中的次黄岑素进行准确定量，其在五倍子蜂蜜中的含量为30～100 μg/kg，而百花蜜中的含量低于5 μg/kg。综上，次黄岑素可作为特征组分对延安地区的五倍子蜂蜜进行质量控制。