生物钟节律和脓毒症交互作用关系的研究进展

常宁 裴颖皓

脓毒症是宿主对感染反应失控导致的威胁生命的多器官功能不全综合征。据统计，全球每年约有新发脓毒症病例4 890 万例，其中死亡约1 100 万例，占全球总死亡人数的19.7%[1]。生物钟振荡调节机制普遍存在于生物体内，全面且深入影响生理生化代谢、睡眠周期以及行为活动等[2]。研究发现脓毒症可导致生物钟节律紊乱，而紊乱的生物钟节律又可以进一步造成细胞周期代谢紊乱、细胞凋亡和机体免疫功能异常等。本文就生物钟节律与脓毒症免疫炎症关系的相关研究进展作一综述，以期揭示脓毒症对于生物钟节律的干扰影响机制，了解生物钟节律的完整稳定对于保护机体免于脓毒症反应失控的重要性，并从现代医学的角度进一步认识传统中医关于“天人相应”“五运六气”“阴阳交替”“子午流注”等关于时间周期节律理论的科学性和合理性，为寻找更为有效的临床治疗方法提供启发，最终改善患者转归预后。

1 脓毒症与生物钟紊乱的交互关系

1.1 生物钟节律紊乱影响脓毒症的病理生理学研究 人体的生理代谢和行为活动等都存在一定的时间节律，是几乎所有生理功能和器官系统稳定运作的基础，这种节律性的改变受生物钟基因所调控。哺乳动物体内的生物钟主要分为中枢生物钟和外周生物钟两类，前者位于下丘脑视交叉上核，后者几乎存在于所有组织器官内。生理情况下，两类生物钟相互调控和影响，负责机体昼夜节律、睡眠-觉醒周期、体温、血压等[3]。脓毒症状态下动物体内生物钟系统可能紊乱。动物实验发现，白天腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）造模的脓毒症小鼠总体死亡率要明显高于夜间造模的脓毒症小鼠[4]。将造模试剂从LPS 改为TNF 腹腔注射，或通过外科手术盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）构建脓毒症模型，依然可见白天造模的脓毒症小鼠死亡率明显高于夜间造模的小鼠[5]。使用CLP 造模的大鼠，脑电图显示睡眠是碎片化的，快速眼动睡眠被抑制，睡眠-觉醒周期受到干扰[6]。临床研究发现，在6：00～12：00 收治的脑膜炎球菌感染导致脓毒症的患儿，其死亡率、截肢率和植皮需求均高于当天其余时间入院的患儿，说明病情严重程度与昼夜节律变化相关[7]。可见生物钟调控生物节律影响脓毒症状态下的病理生理学改变。

1.2 脓毒症影响生物钟节律的研究 脓毒症状态也会影响生物钟节律。生物钟节律性振荡受多个生物钟基因组成的转录负反馈环的调控，这些基因在一个复杂的反馈回路网络中相互作用，导致蛋白质有节奏地表达，帮助调节各种生理过程的时间。该负反馈环由正性组件Clock 蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）及脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1（brain and muscle-arnt-like1，Bmal1）、负性组件昼夜节律蛋白（period circadian protein，Per）1～3 和隐花色素蛋白（crypto chrome，Cry）1～2组成[8]。Clock 基因位于4号染色体长臂，存在于下丘脑前部的视交叉上核。Clock 与Bmal1 形成异二聚体复合物可与靶基因启动子中的特定DNA 序列即增强框（enhancer box，E-box）结合，进一步激活Per 和Cry 转录表达，而后两者蛋白的积累可负反馈抑制Clock-Bmal1 与E-box 的结合。这种转录-翻译负反馈闭环有助于调节昼夜节律，是机体生物钟的核心调控机制[9]。研究发现脓毒症状态下小鼠体内上述生物钟基因水平显著降低，而敲除Per 2 基因可明显降低脓毒症小鼠体内炎症风暴程度，提高小鼠体内皮质醇水平，降低总体死亡率[10]。另一项研究发现，敲除Clock 基因可明显提高脓毒症小鼠的存活率[11]。这两项研究结果均提示，脓毒症状态下生物钟基因波动幅度和节律均出现抑制，无论敲除生物钟正性组件还是负性组件，都可以消除白天和夜间时间点造模对于脓毒症死亡的影响。

可见生物钟与脓毒症关系密切，生物钟调控生物节律影响着脓毒症状态下的病理生理学改变，而脓毒症状态则会造成生物钟的节律波动幅度减弱。

2 脓毒症状态下生物钟紊乱的机制

2.1 免疫炎症介导的生物钟紊乱 脓毒症与生物钟之间的相关分子机制尚未完全明确，目前认为脓毒症状态下免疫炎症风暴和生物钟紊乱关系密切。研究发现LPS 诱导的脓毒症大鼠模型中，白天造模的大鼠体内TNF-α 等炎症因子水平上升速度和幅度明显高于夜间造模的大鼠，因此死亡率也明显升高[12]，而敲除TNF-α 受体和Toll 样受体2 可消除昼夜造模的小鼠死亡差异[13-14]。巨噬细胞的激活与分化是脓毒症炎症损伤中的重要环节，对于LPS 腹腔注射或经CLP 手术造模的脓毒症动物模型来说，腹腔液中的巨噬细胞是最先激动的炎症细胞。研究发现，白天腹腔注射LPS 构建脓毒症模型，大鼠腹腔灌洗液中巨噬细胞大多分化为M1 型，该类型巨噬细胞以促炎反应为主，诱导细胞凋亡和加重局部血栓形成；而夜间造模大鼠的腹腔灌洗液中上述改变明显较轻[12，15-16]。另一项研究发现，在LPS 诱导的脓毒症肝损伤小鼠模型中，敲除Bmal1 基因可造成肝脏组织M1 型巨噬细胞表达增多，肝脏炎症损伤加重[17]。上述结果说明生物钟调控的生物节律影响了脓毒症状态下免疫炎症反应的程度。

脓毒症状态下，宿主对感染反应失控出现免疫炎症状态也会造成生物钟的紊乱。研究发现，无论是LPS 药物造模还是CLP 手术造模，脓毒症动物模型中都可以观察到巨噬细胞Bmal1 基因节律性振荡减弱[18-19]。Bmal1 在脓毒症模型动物炎症反应中的角色存在争论，有研究发现敲除Bmal1 可导致脓毒症小鼠炎症反应加重，死亡率明显升高[20]。但也有研究发现敲除Bmal1 后小鼠的抗炎能力升高[21]。这之间的矛盾可能和脓毒症感染机体免疫状态有关。宿主在感染状态下免疫反应机制极为复杂，可以概括为两个阶段，早期是剧烈的炎症损伤反应，属于免疫亢进状态；后期则属于免疫抑制状态。这种脓毒症不同阶段免疫状态的差异可以解释Bmal1 的抗炎和促炎属性。

上述结果说明，生物钟影响着脓毒症状态下的免疫炎症反应，而脓毒症状态下宿主对于感染产生的失控的免疫炎症反应也会影响生物钟的节律。

2.2 内环境改变导致的生物钟紊乱 生理状态下，机体体温存在昼夜波动，波动幅度约为0.5～1.0 ℃，通常清晨体温最低，下午体温最高，这种波动受生物钟基因调控。脓毒症状态下，患者可出现高热或低体温等体温异常，而低体温也预示着不良临床预后[22]。研究发现，LPS 药物造模和CLP 手术造模的脓毒症动物模型，都可以观察到白天造模的小鼠出现低体温程度更为严重[12，23]。机体的体温控制中枢位于下丘脑的视前区，视交叉上核和室旁核。研究发现LPS 注射后小鼠上述体温中枢电活动增加[24-25]，白天造模小鼠上述体温中枢异常电活动更为剧烈[10]。环境温度的昼夜波动通过外周温度感受器反馈至大脑体温中枢，进而影响体温中枢的生物钟节律；而中枢生物钟节律又进一步调控机体核心温度以适应环境温度。脓毒症可打乱这种双向调节的反馈机制，引起体温调节异常。

糖代谢紊乱是脓毒症状态下常见的代谢改变。由于机体能量代谢异常，糖酵解增加，肝糖原异生代偿能力有限等原因，脓毒症患者易出现低血糖情况，这也是导致脓毒症患者死亡的重要危险因素[26-27]。低血糖的发生与饮食热卡摄入关系密切，而进食的本身也是影响生物钟节律的因素之一。严格控制预处理饮食时间可消除进食对小鼠生物钟的影响，白天LPS造模脓毒症小鼠出现低血糖的发生率与死亡率成正相关，均明显高于夜间造模小鼠[15]；此外在白天造模的小鼠体内还可以观察到核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（Nod-like receptor protein-3，NLRP3）炎症小体的表达水平和活化程度明显上升[28]。NLRP3 炎症小体主要位于细胞浆，由氨基末端的吡啶结构域、中央结构域和羧基末端富亮氨酸重复序列组成[29]。而Clock基因正好参与调控NLRP3 炎性体的表达和活化[30]。脓毒症状态下，NLRP3 炎症小体受病原体相关分子模式等启动信号的刺激而处于高反应性状态，经第二激活信号刺激后，细胞凋亡蛋白酶激活，IL-1β 和IL-18 等促炎因子表达水平升高，通过影响胰岛素功能参与糖代谢[31]。因此，脓毒症状态下，NLRP3 炎症小体被认为是生物钟基因影响血糖代谢的关键调节点，但具体分子机制还需进一步探明。

脓毒症状态下的凝血和纤溶系统功能障碍表现为全身凝血系统活化、抗凝因子大量消耗、纤溶系统功能紊乱等，这些被称为脓毒症相关凝血病。据统计，脓毒症相关凝血病的发生率约为50%～70%，其中35%发展为弥散性血管内凝血[32]。研究发现，Bmal1 基因敲除可造成小鼠纤溶酶原激活物抑制剂-1 表达升高，伴随高凝状态，诱发动静脉血栓的形成[33]。同时，沉默Bmal1 基因可进一步加重脓毒症小鼠凝血因子异常，表现为凝血因子Ⅶ表达下降和凝血因子Ⅻ表达上升[34]。组织因子途径是脓毒症相关凝血病的关键病理机制。在脓毒症状态下，机体过度的免疫炎症反应造成组织器官损伤，大量组织因子释放入血激活外源性凝血途径，诱发高凝状态[35]。研究发现小鼠肝脏组织中组织因子基因转录和翻译存在日节律性，表现为白天合成活跃，夜间合成减少，敲除生物钟Clock 基因后这种组织因子的日节律性消失[36]。由此可见，生物钟调控着凝血和纤溶系统，生物钟节律紊乱与脓毒症相关凝血病密切相关。

3 小结

综上所述，生物钟节律紊乱与脓毒症状态下体温调节异常、能量代谢障碍以及凝血功能失调等内环境紊乱密切相关，见图1。生物钟节律与脓毒症互有联系，相互作用。生物钟调控生物内在节律影响着脓毒症状态下的免疫炎症反应，干预脓毒症状态下的病理生理学改变，可能对于机体恢复平衡稳定状态有益。而脓毒症状态下宿主对于感染产生的失控的免疫炎症反应也会影响生物钟的自身节律，造成生物钟的节律波动幅度减弱。深入研究脓毒症状态下生物钟分子病理机制有助于进一步了解脓毒症的病理机制，寻找到更为有效的临床治疗方法和途径，改善脓毒症临床预后。

图1 脓毒症与生物节律异常