杞麓鲤保种群体的遗传结构分析

刘 娟，袁林聪，李伟斌，白寿有，李进荣，蔡实旺，尹馨玉，孔令富，武祥伟

(1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 361021；2.元江县鱼种技术推广站，云南元江 653300)

我国具有丰富的鲤种质资源和悠久的养殖历史，鲤亚科鱼类区系远较其他国家丰富，地方种多达23种，其中分布于云南的鲤亚科鱼类多达4属18种，云南高原特有种多达12种[1-4]。杞麓鲤(Cyprinuscarpiochilia)即是其中一种，主要分布于云南境内高原湖泊中，是我国普通鲤(C.carpioLinnaeus)四大亚种之一[2]，在上世纪六七十年代它是星云湖、杞麓湖等湖泊中的主要经济鱼类与捕捞对象[3,5]。云南高原特有鱼类生境相对狭窄，对原生境依赖性高，生境变化对它们的生存影响较大。近年来云南高原湖泊外来鱼类入侵、水质污染以及资源和环境过度利用等致使土居种或地方特有种种群数量急剧减少，种质资源退化、外来鱼类基因渐渗等问题日益突出[6-8]。因此，在本世纪初云南境内渔业相关单位以抚仙湖及其水系中的野生种为基础群体，开展了杞麓鲤种质资源保存工作，在杞麓鲤人工繁殖方面取得了突破[9-10]，但保种群体的遗传结构尚不清楚，不利于种群后续保种与提纯复壮。

微卫星分子标记是广泛分布于基因组中的简单串联重复序列(simple sequence repeats,SSR)，基于DNA变异而呈现丰富的多态性，并且它还具有数量多、通用性好，易于操作等特点[11-13]，被广泛运用于水产动物的群体遗传结构分析、种质资源遗传监测、遗传图谱构建和分子辅助育种等方面[14-15]。本研究从杞麓鲤基因组序列中筛选了多态性高的微卫星分子标记，使用这些分子标记对杞麓鲤保种群体进行遗传变异研究，评价保种群体的遗传结构和遗传多样性水平，以期为杞麓鲤种质资源保护与提纯复壮提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

杞麓鲤为玉溪市江川区水产技术推广站养殖基地保种至第四代群体，为2龄个体且均已性成熟，体重(1 198.70±371.64) g，体长(35.90±5.08) cm。随机选取40尾个体，剪取鳍条组织，使用无水乙醇固定并保存于-20 ℃备用。

1.2 基因组DNA抽提

采用传统的酚-氯仿-异戊醇法[16]进行基因组DNA提取，纯化后稀释至50 ng/μL，4 ℃保存备用。

1.3 微卫星位点的开发

使用GMATA 2.0程序[17]从杞麓鲤基因组序列中查找SSR位点并设计PCR引物，经PCR扩增验证后从中随机选取15个多态性高的SSR位点用于群体遗传结构分析(表1)。

表1 杞麓鲤15对微卫星引物序列与特征

1.4 PCR扩增与电泳

PCR反应体系为10 μL，其中PCR mix(Takara，大连宝生物工程有限公司) 8 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1.2 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58或60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经固定、银染、显色后，统计SSR等位基因条带数。

1.5 数据分析

使用popgene32 v1.32软件[18]分析群体的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon′s信息指数(I)，使用FSTAT v2.9软件[19]计算SSR位点的多态信息含量(PIC)、固定指数(Fis)、Nei′s遗传距离(D)，并进行哈代-温伯格平衡(HWE)χ2检验。

使用Bottleneck v1.2.02软件[20]采用两种方法评估群体瓶颈效应，一是杂合度过剩检验，基于无限等位基因突变模型(Infinite allele model,IAM)、双相突变模型(Two-phased model of mutation,TPM)和逐步突变模型(Stepwise mutation model,SMM)计算群体平均期望杂合度(Heq)，Heq与根据等位基因频率计算的He比较，使用标记检验(sign test)和标记秩检验(wilcoxon sign-rank test)对杂合度过剩与否进行显著性检测；二是分析等位基因频率分布，在平衡群体中等位基因频率分布柱状图呈“L”形，而经历过瓶颈效应的群体，等位基因频率发生迁移，偏离平衡状态下的“L”形分布[21]。根据Nei′s遗传距离使用MEGA 10.1软件包[22]构建杞麓鲤群体的系统发育邻接树(neighbor-joining,NJ)，设置Bootstrap 1 000次重复抽样检验。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

在杞麓鲤群体中15个SSR位点均能特异性扩增(图1)，共监测到117个等位基因，平均等位基因数为7.8个/位点，有效等位基因数为3.2～8.9个，平均值为5.8个/位点；期望杂合度为0.696 4～0.900 0，平均值为0.824 4；多态信息含量PIC为0.647 6～0.877 0；其中2个SSR位点属于中度多态(0.5

图1 杞麓鲤1～24个体微卫星分子标记聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验

Hardy-Weinberg平衡检验结果表明10个SSR位点偏离平衡状态，其中8个位点极显著偏离平衡。SSR位点YJL057与YJL073的近交系数Fis小于0，表现杂合子过剩，其余13个位点的Fis值位于0.054 3～0.634 7之间，表现杂合子缺失，保种群体的近交系数Fis均值为0.237 1，近交系数较高，群体内个体间存在一定程度的近交(表2)。

表2 杞麓鲤保种群体的遗传多样性参数与F-统计量

续表2

2.3 群体瓶颈效应分析

基于IAM、TPM和SMM的假设计算了杞麓鲤保种群体在3种突变模型下的期望杂合度(He)与平均期望杂合度(Heq)的差异程度，在IAM假设下，11个SSR位点的He显著大于Heq；在TPM假设下，7个SSR位点的He显著大于Heq；在SMM假设下，4个SSR位点的He显著大于Heq，均表明保种群体在这些SSR位点上偏离了突变-漂移平衡，保种群体经历了瓶颈效应。

使用Sign test标记检验和Wilcoxon test标记秩检验分别对上述3种突变模型下种群瓶颈效应进行检测，结果表明在3种突变模型下保种群体均显著偏离突变-漂移平衡(P<0.05)，表现为极显著的杂合过剩，杞麓鲤保种群体经历了瓶颈效应(表4)。

表4 杞麓鲤保种群体瓶颈效应检测

15个SSR位点的等位基因频率为0.012 5～0.486 5，YJL048与YJL066位点等位基因频率呈典型的“L”形分布，其他13个位点等位基因频率呈现由低频(<0.100 0)向高频迁移，偏离了平衡状态下的“L”形分布，表明杞麓鲤保种群体经历了瓶颈效应(图2)。

图2 杞麓鲤保种群体15个微卫星位点等位基因频率分布

2.4 个体间遗传距离和聚类分析

杞麓鲤保种群体40个个体两两间的Nei′s遗传距离(D)为0.244 8～0.966 7，其中D<0.5、0.5≤D<0.7、0.7≤D<0.8与D≥0.8的两两组合比例分别为0.90%、34.49%、39.62%与25.00%，主要分布于0.5～0.8之间。NJ聚类树表明40个个体具有共同的根，再进一步聚类为2支，包含的个体数分别为7个和33个，33个个体又聚类为2支(图3)。

图3 杞麓鲤保种群体40个个体的NJ聚类树

3 讨论

3.1 保种群体的遗传多样性

遗传多样性是评价种质资源的重要参数，人工保种或选育群体经常发生近交和遗传漂变，因此高的群体遗传多样性对优良性状的稳定和延续至关重要[23]。等位基因数、杂合度与多态信息含量PIC均是评价群体遗传多样性的重要参数。当群体杂合度在0.5～0.8时，即可认为该群体具有较高的多样性，而PIC>0.5时即被认为高度多态性[24-25]。因此，杞麓鲤保种群体的遗传多样性水平较高。中国鲤种类丰富，保种群体的遗传多样性普遍较高，例如黄河鲤群体(C.carpiohacmalopterus)的Ne为7.83，He为0.88，PIC为0.85，黑龙江鲤(C.carpioamurensis)保种群体的Ne为7.68，He为0.87，PIC为0.84[26]，它们的遗传多样性水平高于杞麓鲤；而建鲤(C.carpiovar.Jan)群体的He为0.757 0，PIC为0.725 3[27]，福瑞鲤(C.carpiovar.FFRC)群体的Ne为4.77，He为0.78，PIC为0.73[28]，松浦鲤(C.carpiovar.Songpu)群体的Ne为4.285 2，He为0.751 5[29]，他们的遗传多样性水平低于杞麓鲤，因此与之相比在主要鲤鱼种群中杞麓鲤保种群体的遗传多样性水平处于中等。

3.2 保种群体的遗传结构

杞麓鲤保种群体中Na远大于Ne，表明群体中等位基因分布均匀度较低，存在种群规模变小且有效等位基因丢失现象，而群体的等位基因频率主要集中于小于0.200 0的区间，也与上述推断相符合。物种进化过程中为了增加对生活环境的适应能力会积累较多低频率稀有等位基因(<0.100 0)，而群体经历遗传瓶颈效应后等位基因频率的分布由低频(<0.100 0)转移到中频(0.100 0～0.200 0)，从而偏离种群在突变-漂变平衡状态下的“L”形分布。因此杞麓鲤保种群体的低频率等位基因(<0.100 0)减少、中频率等位基因(0.100 0～0.200 0)增加，表明保种群体受到了选择压力、经历了瓶颈效应[21]；此外，在IAM、TPM、SMM三种突变模型下两种假设检验均检测到了杞麓鲤保种群体经历了瓶颈效应，表明上述选择压力来自瓶颈效应。因此，在Hardy-Weinberg平衡的χ2检验中67%的SSR位点极显著偏离平衡状态。近亲交配、等位基因突变等产生较多的纯合体，均可导致SSR位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡[27]，这些偏离的位点极有可能是因为杞麓鲤保种群体小，发生了近亲交配，导致较多位点纯合及杂合体缺失[30]。此外，样本容量偏小也是导致较多SSR位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡的原因之一。近交系数Fis衡量亚群内的非随机交配引起的个体杂合度降低[31]，杞麓鲤保种群体的13个SSR位点的Fis值均为正数，表明保种群体杂合子缺失。当Fis>0，则Ho

综上所述，杞麓鲤保种群体仍具有较高的遗传多样性水平，但保种过程中的人工选择压力对保种群体产生了显著影响，群体遗传结构发生较大变化，表现为群体等位基因分布不均、杂合子缺失或有效等位基因丢失、多数SSR位点偏离Hardy-Weinberg平衡等现象，保种群体经历了瓶颈效应，并且存在一定程度的近交。因此，在保种过程中应补充原种个体以扩大群体规模。