16S rDNA克隆文库法分析小龙虾肠道细菌多样性

郑居神，何浣纱，胡奥，石玉，冯光志*

武汉设计工程学院食品与生物科技学院（武汉 430205）

克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称小龙虾，20世纪20年代由日本传入我国，并迅速在我国广泛传播[1-2]，到20世纪70年代，伴随小龙虾饮食文化的兴起，小龙虾养殖产业开始飞速发展，使得我国迅速成为世界上最大和最重要的小龙虾生产国[3-4]。

小龙虾产业取得长足发展，但伴随小龙虾养殖规模和经济体量的不断增长，养殖过程中存在的一些问题开始显现，进而推动小龙虾规模养殖的相关科学研究。这些研究主要集中于小龙虾的行为学、养殖密度、疾病和免疫及饲料中蛋白质、脂肪配比等方面[5]。随着研究的不断深入，科研工作者开始对小龙虾肠道微生物逐渐重视起来，肠道微生物在水产动物生长代谢、营养吸收以及免疫抗病等方面发挥重要作用[6]，与小龙虾的健康息息相关[7]。

小龙虾的健康与其肠道微生物的菌群结构密不可分。王飞飞等[8]采用高通量测序技术，对稻虾共作模式下克氏原螯虾肠道中菌群多样性进行研究，结果发现克氏原螯虾肠道中优势细菌种类为厚壁菌门（42.16%）、变形菌门（13.78%）和柔膜菌门（13.07%）。李飞等[9]采用高通量测序方法分析2种养殖模式下克氏原螯虾肠道的微生物多样性和群落结构，结果显示池塘和稻田养殖克氏原螯虾肠道微生物在物种组成上、多样性上都存在明显差异。高通量测序技术因其能完整反映测试样品的菌群结构特征，是研究微生物菌群结构的重要工具[10]，而16S rDNA克隆文库法技术成熟，可操作性好，在反映优势菌群方面具有一定优势[11]。鉴于此，试验采用16S rDNA克隆文库法，对小龙虾肠道共生细菌进行系统发育分析，通过揭示小龙虾肠道微生物优势菌群，探讨这些微生物在食物消化过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

小龙虾（实验室虾池人工养殖）。

1.2 培养基及试剂

LB液体培养基：取10 g胰蛋白胨、5 g酵母抽提物、10 g氯化钠，用蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌至完全溶解，于1×105Pa灭菌20 min。X-Gal：取25 mg固体X-gal溶解于1 mL的二甲基甲酰胺中，于-20 ℃避光保存。IPTG：称取250 mg IPTG溶解于10 mL去离子水中，抽滤分装后，于-20 ℃贮存。PCR引物的合成及测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。限制性内切酶Afa Ⅰ和MspⅠ、Taq酶、dNTP、pGEM-T Vector等（购于TaKaRa公司）；DNA提取试剂盒、PCR纯化试剂盒（购于天源公司）。

1.3 CTAB法提取小龙虾肠道总DNA

采用CTAB法提取小龙虾肠道的总DNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

1.4 小龙虾肠道细菌16S rDNA的扩增

以提取的小龙虾总DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F，1492R进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行30个循环，72 ℃延伸7 min。

1.5 小龙虾肠道共生细菌16S rRNA基因文库的构建

PCR结束后，将纯化后的PCR产物与pGEM-T easy载体在4 ℃条件下进行连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取平板上阳性克隆，以M13为引物进行PCR扩增，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，验证序列是否正确插入，片段在1 700 bp左右。对插入正确序列的克隆分别采用限制性内切酶Afa Ⅰ和MspⅠ这2种酶进行酶切，酶切产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，对酶切图谱进行限制性片段长度多态性分析。若同一克隆2种酶的酶切图谱相同则归为一类，称之为相同的克隆型。从具有相同克隆型的克隆中选取1～2个克隆送上海桑尼公司测序。

1.6 序列分析与系统发育树的构建

序列经DNAstar软件分析后，通过NCBI的BlastN搜索同源性较高的已知序列，利用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 小龙虾肠道共生细菌16S rDNA的PCR扩增

以小龙虾的总DNA为模板，用细菌通用引物27F，1492R进行PCR扩增，得到约1 500 bp的条带，与预期的大小一致。

2.2 小龙虾肠道共生细菌16S rDNA文库的建立

随机挑取平板上大肠杆菌DH5α白色菌落，以M13为引物，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测得到共计369个含有正确插入序列的克隆，分别用限制性内切酶AfaⅠ（图1）和MspⅠ（图2）对所得到的这369个含有正确插入序列的克隆进行酶切，并进行限制性片段长度多态性分析。根据核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析（ARDRA），将这369个阳性克隆分为35个不同的ARDRA型，其中AfaⅠ共得到19种克隆型，MspⅠ共得到16种克隆型。

图1 小龙虾肠道共生细菌16S rDNA PCR产物的Afa Ⅰ的部分酶切图谱

图2 小龙虾肠道共生细菌16S rDNA PCR产物的MspⅠ的部分酶切图谱

2.3 小龙虾肠道共生细菌的系统发育分析

将35种克隆型分别随机挑取1～2个克隆测序，并将序列相似性大于99.5%的克隆视为相同克隆型，最终得到24个不同的克隆型，将得到的这24个细菌16S rRNA基因序列在GenBank数据库中进行BLAST分析，结果显示小龙虾肠道共生细菌的16S rRNA基因分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属细菌的16S rDNA序列最为接近，相似性为83.6%～99.4%。在系统发育树（图3）上，各个克隆分别形成不同的簇，说明小龙虾肠道微生物多样性非常丰富。有些克隆序列与Genbank中最相近序列的相似性低于95%，可能是迄今尚未描述的新种。

图3 基于16S rDNA的小龙虾肠道共生细菌的系统发育分析

3 讨论与结论

肠道菌群结构复杂，种类繁多，但大体可以划分为3种类型：共生菌群，占肠道菌群的绝大部分，这些微生物多是益生菌，和宿主一起行使多种生理功能；条件致病菌群，当宿主处于健康状态时，这些微生物很安分，能够和宿主和平相处，但当宿主处于病变状态，肠道菌群发生紊乱时，条件致病菌就会引发多种肠道疾病；致病菌群，通常经过环境进入肠道，导致病变。肠道微生物在维持宿主健康中发挥重要作用，肠道菌群结构对宿主健康具有指示作用。贾丽娟等[12]通过高通量测序技术研究武汉地区的克氏原螯虾肠道的优势菌属，结果为柠檬酸杆菌属、气单胞菌属和Anaerorhabdus furcosagroup等。试验从小龙虾肠道共生细菌中得到的24个16S rRNA基因序列，分别归于柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属等12个属，与贾丽娟等[12]的研究一致，说明小龙虾肠道具有相对固定的菌群结构，可考虑筛选指示小龙虾健康状况的细菌种群。

肠道微生物栖居于宿主肠道内，与宿主形成共生关系，作为宿主体内最庞大最复杂的微生态系统，肠道微生物及其代谢产物不仅能调节宿主健康，在宿主消化与代谢、疾病与免疫等方面都发挥着重要作用[13]。关于肠道微生物的研究，主要集中在3个方面：一是肠道微生物群落的结构及其演替规律[14-16]；二是肠道微生物菌群结构的影响因素[17]；三是肠道微生物的生理功能[18]。这些研究主要还是集中在人、小鼠及斑马鱼等生物上，关于小龙虾肠道微生物方面的研究还较少，且多集中于肠道微生物群落结构及其影响因素方面。肠道微生物与小龙虾的生理健康息息相关，研究肠道微生物的菌群结构和生理功能，对小龙虾养殖和饲料配方的研制都具有极其重要的作用。试验从小龙虾肠道得到24个细菌16S rDNA序列，系统发育分析表明，这些克隆分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属细菌的16S rDNA序列最为接近。这些属的细菌中有很多具有产酶能力，如：巨型球菌属微生物产淀粉酶、蛋白酶；拟杆菌属细菌能够分解糖和蛋白质[19]；柠檬酸杆菌属微生物能利用柠檬酸盐，发酵葡萄糖；希瓦菌属降解染料[20]；梭菌属细菌可以发酵糖、醇和其他有机物；Sinanaerobacter能降解乙草胺和丁草胺等[21]。这些肠道微生物在辅助小龙虾消化食物的过程中发挥着不可替代的作用，可能还存在许多的新种，它们行使的生理功能和作用机制仍有待深入探究，同时，小龙虾肠道中也存在一定比例的条件致病菌，如丹毒丝菌属[22]、希瓦氏菌属微生物[23]，在一定条件下可导致小龙虾致病，为维持和改善小龙虾肠道菌群结构，投喂微生物制剂是行之有效的办法。