桃金娘多酚的响应面优化提取及抗氧化活性研究

徐艳，邱元凯，何欢，罗文敏，方广平，骆玮诗*

1.河源职业技术学院（河源 517000）；2.河源市吉龙翔生物科技有限公司（河源 517000）

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）又称为稔子、山稔及乌肚子，是一种常绿花多的小灌木，属于桃金娘科桃金娘属植物，主要分布于中国南部，如台湾、广西、广东、云南、湖南等地。桃金娘抗逆性强，常生长在贫瘠的丘陵坡地，是一种优良的药食同源类野生植物资源。桃金娘性味甘涩平，以根、叶和果入药，具有养血、止血、涩肠、固精之功效[1]，其果实中含有三萜类、黄酮类、鞣酸（单宁、多酚）类、多糖类及色素类化学成分[2]。国内外研究数据表明，桃金娘具有很高的抗氧化活性，每克桃金娘的DPPH（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼）与28.5 μmol没食子酸、67.2 μmol抗坏血酸（VC）[3-4]相当。桃金娘具备诸多生物活性，包括抗病毒、抗菌与抗氧化等[5-12]，体现出广泛的应用价值，是应用开发价值较高的一类野生资源。相关研究显示，桃金娘总酚含量很高，这决定了其果实抗氧化活性较高[13]。因此，对桃金娘多酚提取条件进行优化，以提高多酚提取量，对桃金娘抗氧化活性相关产品开发应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桃金娘果实干货（烘干后粉碎，过0.150 mm孔径筛，即100目）。

没食子酸对照品（含量≥98%）、无水乙醇、无水碳酸钠、福林酚试剂、无水甲醇、DPPH、ABTS（2, 2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、VC、草酸（均为国药集团产品）。

1.2 主要仪器与设备

UV1700紫外-可见分光光度计（日本岛津）；Mil-li-Q超纯水仪（Millipore公司）；F160型粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；FA2004B分析天平（精度0.000 1 mg，上海佑科公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

通过没食子酸的当量（GAE）表示总多酚含量（mg GAE/g，干质量）。分别将质量浓度皆为1.0 mg/mL但体积不同的标准没食子酸溶液移入容量瓶（50 mL）内，分别吸量1 mL稀释液放到比色管（10 mL）内，添加5 mL去离子水，加入1 mL的福林酚显色剂（1∶9，V/V），摇匀，添加3 mL的Na2CO3溶液（7.5%），避光静置1 h后，进行最大吸收波长扫描[14-15]，得到的最大吸收波长为754 nm，测定待测溶液的A754nm。以横坐标为多酚质量浓度（以没食子酸计），纵坐标为A754nm进行标准曲线的绘制，获得多酚标准曲线方程，见式（1）。

式中：x为多酚质量浓度（以没食子酸计），μg/mL；y为所对应的吸光度（A754nm）。

1.3.2 单因素试验设计

逐一考察处理温度、料液比、提取时间、无水乙醇体积分数等单因素影响桃金娘多酚提取量状况。提取步骤：准确称取2.0 g相同批次的桃金娘果实粉末，设置不同料液比（1∶70～1∶120 g/mL），分别添加不同体积分数溶剂（30%～80%），在不同温度（50～100℃）进行不同时间（0.5～3.0 h）的提取，并逐一抽滤，并收集上清液作为提取液，精准吸量1 mL提取液，稀释至10 mL，计算不同条件下的桃金娘多酚提取率。

在单因素试验基础上对4个影响因素进行筛选，选出对多酚提取效果具有显著影响的3个因子，为响应面优化试验设计提供基础。

1.3.3 响应面优化试验设计

基于单因素试验结果，数据分析所用工具为Box-Behnken，将桃金娘多酚提取量作为响应值，选取存在较显著影响的3项因素，即提取温度、料液比与乙醇体积分数开展响应面分析，围绕工艺条件开展三因素三水平试验设计，对提取桃金娘多酚的工艺进行优化。响应面试验因素与水平设计情况如表1所示。

1.3.4 桃金娘多酚提取物体外抗氧化活性的测定

按照确定的最优提取条件提取桃金娘多酚，并对提取物进行抗氧化活性评价分析。

1.3.4.1 ABTS+·清除能力测定[15]

取多酚提取液溶液配制成不同质量浓度的溶液待测。吸取不同浓度样品溶液2和8 mL ABTS工作液，振荡10 s，彻底混合，经过6 min静置，检测A730nm，平行测定3次，ABTS+·清除能力见式（2）。

式中：A0为样品空白吸光度：Ai为样品吸光度；Aj为样品本底吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力测定[16]

分别取3 mL不同浓度水平的样品液，同时添加3 mL的DPPH乙醇溶液（0.16 mmol/L），置于25 ℃水浴锅中加热15 min，对不同浓度水平的样品液A517nm（Ai）进行测量。同时，测量样品本底吸光度（Aj）与空白吸光度（A0），通过式（3）对DPPH消除率进行求解。

1.4 数据处理与统计分析

各项试验皆进行3遍重复，试验数据的整理绘图借助软件Origin 2018完成，在数值的PCA主成分分析方面，应用的软件为past，借助软件JMP 10.0完成响应面试验的设计及整理绘图工作，采取方差分析（ANOVA），差异显著的要求为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 桃金娘果实多酚提取的单因素试验结果

2.1.1 料液比对桃金娘多酚提取量的影响

当提取时间2 h，温度80 ℃，乙醇体积分数50%时，考察料液比对桃金娘多酚提取量的影响，如图1（a）所示。料液比在1∶70～1∶110（g/mL）的范围内，提取量与乙醇添加量正相关，料液比1∶110（g/mL）时可获得最大多酚含量22.90 mg GAE/g，继续增加溶剂含量多酚提取量开始降低，可见此时已无多酚物质溶出。所以，在响应面优化试验中，设定料液比1∶80～1∶120（g/mL）。

2.1.2 乙醇体积分数对桃金娘多酚提取量的影响

当提取时间2 h，温度80 ℃，料液比1∶110（g/mL）时，考察浸提溶剂乙醇体积分数对桃金娘多酚提取量的影响，如图1（b）所示。增加乙醇体积分数后，桃金娘多酚提取量大幅提高，乙醇体积分数40%～50%时，桃金娘多酚提取量达到最高的29.45 mg GAE/g，继续增加溶剂体积分数，多酚提取量开始明显降低。此外，若乙醇体积分数过高，会提高分离纯化难度，同时导致资源浪费，所以，在响应面优化试验中设定乙醇体积分数30%～70%。

2.1.3 提取时间对桃金娘多酚提取量的影响

当料液比1∶110（g/mL），乙醇体积分数40%，提取温度80 ℃时，考察提取时间对桃金娘多酚提取量的影响，如图1（c）所示。提取时间从0.5～1.5 h，桃金娘多酚提取量有少量提升，继续延长提取时间，桃金娘多酚提取量基本稳定并有少许下降，在1.5 h时达到最高的30.29 mg GAE/g，仅比最低提取量提升6.92%，说明提取时间对桃金娘多酚的影响不显著，结合节省能源的考虑，设定提取时间1 h进行后续试验。

2.1.4 提取温度对桃金娘多酚提取量的影响

当料液比1∶110（g/mL），乙醇体积分数40%，提取时间60 min时，考察提取温度影响桃金娘多酚提取量状况，如图1（d）所示。在提取温度提高的前提下，桃金娘多酚提取量有明显增加，并在90 ℃时达到最大的31.19 mg GAE/g，继续增加提取温度，桃金娘多酚提取量开始降低，这可能是因为高温容易引起多酚类物质的分解，因此，在响应面优化试验中设定提取温度60～100 ℃。

图1 单因素试验结果

为进一步优化最佳提取条件，采取响应面优化试验设计从4个单因素中筛选出显著影响的3个因素，图1根据多酚提取量的变化明显可以看出，4个影响因素中的提取时间属于不显著影响的因素，因此把乙醇体积分数、提取温度与料液比设置为后续响应面试验的因素，其试验水平见表1。

2.2 提取桃金娘果实多酚的响应面优化试验结果

2.2.1 响应模型的建立与分析

响应面试验设计所用工具为Box-Behnken，优化同时确定多因素系统中最优测试条件，具体试验设计详情如表2所示，其中各模式皆安排3次平行试验，将均值作为终值。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应面试验结果分析

借助软件JMP 10.0对表2所示各条件下试验数据实施拟合，获得多酚提取量对乙醇体积分数（X1）、温度水平（X2）与料液比（X3）的RM（回归模型）方程：多酚提取量=31.40-1.27X1-1.59X2-0.35X3+0.55X1X2+0.50X1X3-0.16X2X3-3.43X12-4.55X22-1.02。

由表3可知，RM存在高度的显著水平（P值为0.000 7，在0.001以下），失拟项缺乏显著性（P=0.150 4＞0.05），R2为0.982 6，Radj2为0.951 1，可见此模型试验误差不明显，具良好拟合度，可以呈现响应值的变化，能通过该方程模型分析与预测乙醇浸提法进行桃金娘果实多酚提取的工艺参数。回归模型显著性检验结果显示，X1、X2、X12、同多酚提取量存在极显著联系（P＜0.01），X32同多酚提取量存在显著联系（P＜0.05）。基于F值，各个因素同桃金娘多酚提取量相关性程度由重至轻排序为提取温度（X2）＞乙醇体积分数（X1）＞料液比（X3）。

两两因素交互效应响应面如图2所示。各因素交互效应响应面开口皆向下，可见在各因素增大的同时，响应面值皆为提升表现，待至最大值又慢慢下降。响应面坡面愈陡峭，表示试验因素对桃金娘果实多酚提取量影响于显著，反之其愈平缓，试验因素的影响则愈弱；乙醇体积分数与提取温度两因素间的交互效应响应面坡面最陡峭，且从表3的两两交互作用的显著性检验数据也可得知，乙醇体积分数与提取温度的相关性稍强于其他因素间的组合，由等高线分析发现，就影响多酚提取程度而言，提取温度较强，料液比则较弱。

表3 多酚提取量为响应值的方差分析

图2 以多酚提取量为指标的响应面图

2.2.3 响应面试验优化及验证试验

经JMP 10.0软件模型分析，预测桃金娘果实多酚最佳提取工艺：乙醇体积分数45.71%、提取温度76.30℃、料液比1∶95.78（g/mL），此时理论多酚提取量为31.715 6 mg GAE/g。基于实际操作，对提取桃金娘果实内多酚的工艺做出设计：料液比1∶95（g/mL）、乙醇体积分数45%、提取温度76 ℃，此条件下实施3次平行试验，计算桃金娘多酚提取量，均值是32.58±0.24 mg GAE/g，结果与预测的理论相近，且高于正交试验中各试验的提取量，表明模型拟合良好，最佳工艺合理，参数准确可靠。

2.3 桃金娘果实多酚的抗氧化活性

2.3.1 清除ABTS+·活性

试验结果显示桃金娘果实多酚具有很高的ABTS+·清除能力，与抗坏血酸的清除效果接近（见图3）。增加桃金娘果实提取的多酚样品对ABTS+·清除率表现为先升高再趋于平稳，浓度和活性存在正相关，多酚质量浓度超过25 μg/mL后，仍保持98.4%的高清除率。而阳性对照中抗坏血酸浓达到20 μg/mL后，清除率活性稳定并达到100%。通过Origin 2018软件拟合，桃金娘多酚对ABTS+·的半抑制浓度（IC50）为10.93 μg/mL，对照品VC的IC50为8.52 μg/mL，这一结果显示，根据前期条件优化试验获得的桃金娘多酚样品有很好的清除ABTS+·能力，与同浓度的抗坏血酸效果相近。

图3 桃金娘多酚对ABTS+·清除作用

2.3.2 清除DPPH自由基活性

试验结果显示，桃金娘多酚清除DPPH的能力较强（见图4）。桃金娘果实提取的多酚浓度与其对DPPH清除率也符合正相关量效关系，待质量浓度超过10.75 μg/mL后保持83.77%左右的DPPH清除率，略低于对照品抗坏血酸的清除活性（93.79%），经Origin 2018软件拟合，对于自由基DPPH，桃金娘多酚的IC50为4.47 μg/mL（对照品VC的IC50为1.12 μg/mL）。对于自由基DPPH，桃金娘多酚表现出较强的清除能力，约为浓度相当时VC清除DPPH能力的89.3%。

3 结论

在使用乙醇浸提法提取桃金娘果实多酚的单因素试验基础上，利用Box-Behnken响应面优化试验设计软件确定的最佳工艺条件：乙醇体积分数45%、提取温度76 ℃、料液比1∶95（g/mL），所得桃金娘多酚提取量为32.58±0.24 mg GAE/g。通过比较不同浓度下的桃金娘多酚与对照品维生素C体外抗氧化活性发现，对于ABTS+·与DPPH，桃金娘多酚皆表现出较强的清除活性，抗氧化能力接近维生素C的水平，其清除ABTS+·自由基、DPPH自由基半抑制浓度（IC50）分别为10.93和4.47μg/mL。试验结果可为野生桃金娘多酚的进一步开发利用及抗氧化活性产品的研发提供理论依据。