氟康唑联合乳杆菌对RVVC的疗效及免疫因子水平的影响

石文印 陈伟鸿 张亚娇 李 卫

外阴阴道假丝酵母菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC) 是由念珠菌菌属引起的常见真菌感染，典型特征是外阴和阴道出现白色豆渣样分泌物、灼痛、发红和瘙痒，以及性交困难，约有70%的女性在育龄期间至少会发生1次VVC[1,2]。其中有8%～10%的女性会出现复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)，即每年发作4次或更多次，据统计全球每年约有1.38 亿女性患有RVVC[1～3]。RVVC 是一种使人衰弱的长期疾病，与VVC比较更能严重影响女性的生活质量[4]。且RVVC 患者需要长期使用抗真菌药数月或更长时间的巩固方案，以避免复发，但是由于缺乏统一的临床用药标准，大多数 RVVC患者是根据经验进行诊断和自我治疗，这可能导致了抗真菌耐药性增加[3]。

氟康唑作为RVVC的以往治疗的首选药物，具有广谱抗真菌作用，但近年来各项报道表明唑类药物的耐药率不断增加，且单一长期使用会产生不良反应、治愈率低[5]。此外，RVVC对人体Th1、Th2炎性细胞因子及免疫细胞水平有所影响[6]。而乳酸杆菌作为阴道内的优势菌群之一，可维持阴道的微生态平衡，防止生殖道感染，并且已被证实可调节机体免疫反应，抵抗致病菌侵袭[7, 8]。但氟康唑联合乳杆菌用药的临床疗效、炎性细胞因子水平变化是否较单独使用氟康唑治疗有明显改善，此研究报道的相关数据仍较少。因此本研究通过对RVVC患者进行口服氟康唑联合乳酸杆菌阴道用药后，探讨患者的疗效和治疗前后免疫细胞及相关炎性细胞因子水平变化及临床意义，为RVVC的临床用药提供一定的参考依据。

资料与方法

1.研究对象：收取江苏大学附属第四医院妇科门诊2020年5月～2021年6月确诊为RVVC的患者120例作为研究对象，将患者采用随机数字表法分为观察组(n=60)和对照组(n=60)。纳入标准:①参照美国CDC《2021年性传播感染诊治指南》外阴阴道假丝酵母菌病诊治解读中VVC的确诊标准[9]：有阴道炎症状和体征的女性如果阴道分泌物湿片法或革兰染色涂片(0.9%氯化钠溶液，10% KOH)显示出芽生孢子、菌丝或假菌丝，通过真菌培养或其他试验能够证实酵母菌阳性，则可诊断为VVC，1年内有症状的VVC发作3次或3次以上可判定为RVVC；②患者同时有外阴瘙痒、白带异常、烧灼感、尿频尿痛等症状和体征；③每月大约规律性发作1次；④均为非妊娠的育龄期女性；⑤就诊前1周未服用过抗生素；⑥就诊前3天未进行阴道灌洗或阴道用药；⑦无药物过敏史。排除标准：①合并其他妇科生殖道感染(细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、盆腔炎等)；②处在妊娠期或哺乳期的女性；③患有精神性疾病，未能进行良好的配合；④患有其他系统性自身免疫性疾病；⑤服用激素及皮质类固醇激素期间。两组患者均签署知情同意书，本研究通过笔者医院医学伦理学委员会审批(伦理审批号：202011)。观察组患者平均年龄为36.95±11.36岁，对照组患者平均年龄为34.77±9.00岁。两组患者年龄、病程、体重指数、婚否以及阴道清洁度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.研究方法：两组同时在1、4、7天予口服氟康唑150mg(天津华津制药有限公司，国药准字：H20023678)，以后每月月经前用药1次，每次150mg，连用3个月；观察组在此基础上在阴道后穹隆放置阴道乳酸杆菌活菌250 毫克每晚(西安正浩生物制药有限公司，国药准字：H10980393)，连用10天，以后每月月经至少前10天用药1次，每次连用10天，持续3个月。用药治疗期间所有患者禁性生活，勤换内裤，用过的内裤、盆及毛巾应用开水烫洗，同时避开月经。

3.观察指标：(1)临床症状改善时间：比较两组患者在治疗后随访期间临床症状消失时间。(2)VVC评分标准[10]：对患者的外阴症状严重程度进行评分，比较两组患者治疗前后VVC评分。(3)疗效评判标准：两组患者在3个月疗程结束后进行疗效评判。治愈：临床症状完全消失，妇检及阴道分泌物实验室检查均正常；显效：症状明显得到明显改善，偶有轻微瘙痒症状，妇检和白带检查基本正常；有效：临床症状有一定改善，但随访时间内患者有复发情况发生；无效：患者经治疗后临床症状未得到缓解，假丝酵母病原培养阳性。总有效率(%)=(治愈+显效+有效)/总例数×100%。(4)生存质量分析：应用健康调查简表(the MOS item short from health survey，SF-36)，即生存质量量表评估两组患者治疗后生存质量，得分越高, 其生活质量越好[11]。(5)不良反应率和复发率：比较两组在用药后不良反应的发生率和随访时间内的复发情况。(6)对患者治疗前及初次治疗结束后3个月阴道分泌物及外周血中免疫细胞及相关细胞因子水平进行检测：其中炎性细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、INF-γ检测采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)，均按照试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)说明书中的步骤进行操作。采用FASC alibur流式细胞仪(美国 Becton Dickinson and Company公司)对患者阴道分泌物及外周血中T淋巴细胞亚群水平进行检测。

结 果

1.两组临床症状改善情况：两组患者初次治疗后3个月内，观察组白带异常恢复时间明显较对照组短(P<0.05)，详见表1。

表1 两组临床症状消失时间比较天)

2.两组患者治疗前后VVC评分比较：两组患者治疗前和初次治疗后3次复查VVC评分均不断降低(P<0.001)；治疗前两组VVC评分比较，差异无统计学意义，治疗3个月后观察组低于对照组(P<0.001)，详见图1。

图1 两组患者治疗前和初次治疗后3次复查的VVC评分比较与观察组比较，*P<0.001

3.两组患者临床疗效比较：两组初次治疗后3个月，观察组治愈26例、显效26例、有效7例、无效1例；对照组治愈20例、显效19例、有效13例、无效8例。观察组总有效率为98.3%，对照组为86.7%，观察组总有效率相较于对照组高，差异有统计学意义(χ2=9.116，P=0.028)。

4.两组患者生存质量比较：治疗前两组各项评分比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；对照组在初次治疗后3个月，精神、情感状态评分均高于治疗前(P<0.05)；观察组在初次治疗后3个月，精神状态、情感状态、生理功能评分均高于治疗前(P<0.05)；初次治疗后3个月观察组各项评分较对照组高，且两组间情感状态、社会功能、生理功能评分比较，差异均有统计学意义(P均<0.05，表2)。

表2 两组生存质量比较分)

5.两组不良反应和复发率比较：观察组患者有3例轻度阴道不适，4例性欲下降，无恶心、呕吐发生；对照组患者中发生9例阴道不适，11例性欲下降，3例恶心、呕吐。观察组患者总体不良反应率(11.7%)低于对照组(38.3%)，差异有统计学意义(χ2=11.378，P<0.05)。观察组有7例复发，复发率为11.7%；对照组有16例复发，复发率为26.7%，观察组复发率较对照组明显降低(χ2=4.357P<0.05)。

6.两组患者治疗前后阴道分泌物和外周血中免疫细胞及相关细胞因子水平： 治疗前，两组各项水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。初次治疗后3个月两组患者阴道分泌物和外周血中Th2相关细胞因子[白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10]、CD8+水平低于治疗前，且观察组均低于对照组患者(P<0.05)；Th1相关细胞因子[肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、IL-2、干扰素(interferon,IFN)-γ]、CD4+、CD4/CD8水平高于治疗前，且组间比较观察组水平差异有统计学意义(P<0.05)，详见图2、图3。

图2 两组患者治疗前后阴道分泌物中免疫细胞及相关细胞因子水平比较A.两组患者分泌物中治疗前后CD4+、CD8+、CD4/CD8水平变化；B.两组患者分泌物中治疗前后Th1相关细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平变化；C.两组患者分泌物中治疗前后Th2相关细胞因子IL-4、IL-10水平变化。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

图3 两组患者治疗前后外周血中免疫细胞及相关细胞因子水平比较A.两组患者外周血中治疗前后CD4+、CD8+、CD4/CD8水平变化；B.两组患者外周血中治疗前后Th1相关细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平变化；C.两组患者分泌物中治疗前后Th2相关细胞因子IL-4、IL-10水平变化。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

讨 论

RVVC 是一种多因素疾病，其症状受假丝酵母菌(物种和毒力因子)、乳杆菌种群、微环境(炎症状态、氧化应激、雌激素)和宿主(免疫状态、行为因素、遗传因素)之间的相互作用控制，任何这些因素的失衡都可能导致 RVVC[4]。因而很难找到一种预防RVVC复发并适合所有患者的方案，且近几年RVVC的发生率逐年上升，严重影响患者的生活质量和身心健康[12]。有效治疗 RVVC，充分控制症状并根除真菌，是日常临床实践中的一项挑战。目前治疗VVC/RVVC最常用的药物包括三唑类、咪唑类、多稀类等，不同的抗真菌药物具有相似的功效，并且口服和阴道用药两种途径都促进了适当的治疗[13]。临床诊治指南提出RVVC强化治疗口服用药方面，指南均推荐氟康唑，150mg，顿服，第 1、4、7天应用。巩固治疗是在强化治疗的基础上进一步减少RVVC 的发作。目前尚无较为成熟的方案，建议对每月规律性发作 1 次者，可在每次发作前预防用药 1 次，连续 6个月。对于无规律发作者，可采用每周用药 1 次，连续 6个月。但规范并未给出具体的用药方案[9]。虽然RVVC的临床推荐标准治疗的一线药物是氟康唑，但此为非处方药，长期服药大大增加了耐药率[5]。

相关研究显示乳酸杆菌在维持健康的阴道微生态环境发挥着重要作用，不仅可以降低阴道 pH 值，还可以通过与微生物竞争减少潜在病原微生物的机会性感染，这减少了念珠菌物种对阴道上皮的黏附[14]。且乳杆菌种群失衡也是导致RVVC发作的重大因素，因此用氟康唑进行强化和维持治疗RVVC的同时，在阴道补充乳酸杆菌，可恢复阴道微环境的健康状态[4]。Witt 等[15]的研究中伊曲康唑组维持疗法采用每月服用1次伊曲康唑200mg，维持治疗6个月；伊曲康唑+乳杆菌组维持治疗方法采用上述治疗同时，加用阴道乳杆菌1片/天，连续用6天/月，持续6个月，结果显示伊曲康唑+乳杆菌组复发率低于伊曲康唑组。

本课题组在2017年的研究中患者均予乳酸杆菌250mg塞阴道后穹隆，每天1次，连用10 天。观察组在治疗第1、4、7天加用氟康唑150mg，每天1次；对照组予制霉菌素栓10万单位(U)，每晚塞阴道后穹隆，连用14天，比较两组疗效、不良反应及复发率，结果提示氟康唑联合乳酸杆菌治疗 RVVC临床疗效更好[16]。所以，本研究在此用药方法的基础上探讨氟康唑和氟康唑联合阴道用药的疗效。在维持治疗的观察时间方面，傅燕红等[17]对RVVC进行了3个月维持治疗的疗效观察。且因患者依从性较低，大部分无法按照医嘱持续服药6个月，若要求无规律性发作的患者每周服药维持6个月，大多数患者在症状完全缓解后自行停药。所以本研究中收集有大约每月规律发作的患者作为研究对象，此类型患者依从性高，因月经前后易发作RVVC，所以在患者月经来潮前预防用药，进行3个月维持治疗的观察。

本研究对所患者的症状进行记录，最终将筛选出同时有外阴瘙痒、灼烧感、尿频尿痛、白带异常典型症状的120例患者进行3个月两组不同治疗后，分析典型的4种临床症状消失时间。观察组复检时的临床症状消失时间较对照组短；两组VVC评分均较治疗前低，且治疗后观察组评分低于对照组，说明乳杆菌辅助治疗RVVC不仅更能有效缓解患者症状，还可在更短的时间内缓解患者的不适症状。相关研究发现氟康唑长期治疗虽可降低有症状的VVC的复发率，但长期治愈率仍然难以实现，并且过度使用此类药物会产生其他不良后果，例如水肿、皮肤过敏，甚至可能导致慢性外阴疼痛[18]。而乳酸杆菌阴道制剂目前尚没有表现出明显的不良反应，在女性群体中接受度很高[19]。本研究结果提示观察组总有效率高于对照组；观察组总体不良反应率低于对照组。说明在口服氟康唑基础上联合阴道乳杆菌治疗不仅提高了临床疗效，还降低了药物毒性，与Demin 等[7]、Oerlemans等[20]的研究结果一致。

RVVC对女性及其伴侣的身体和心理都有严重影响，Zhu 等[11]采用SF-36量表报告了RVVC 患者的健康相关生活质量受到显著影响。Kovachev 等[21]研究报告了使用益生菌与唑类药物相结合治疗VVC，降低了复发率，提高了患者生活质量。本研究结果显示，治疗后观察组的情感状态、社会功能、生理功能的生存质量评分明显优于对照组；治疗3个月后观察组患者的复发率低于对照组，与Kovachev 等[21]的结果一致。以上结果表明，乳杆菌阴道用药在RVVC治疗中的效果良好，不仅无明显不良反应，并且一定程度上降低了RVVC的复发，还提高了患者的生活质量。笔者考虑其原因可能是由于单一应用氟康唑，治标不治本；或者因既往未按照医生指导自行服用唑类药物而形成耐药，长期用药不仅不能有效清除阴道内的细菌，还容易导致阴道内菌群失调和微生态紊乱，这可能使阴道无法再重建正常的以乳酸杆菌为主的阴道菌群，从而长期单一使用氟康唑会降低治愈率，而联合乳杆菌阴道用药抑菌效果更好并达到了内外兼治的效果，有效缓解了这一问题。

RVVC由于在生命早期接触过念珠菌，大多数具有免疫能力的个体已经对念珠菌产生了适应性免疫，病原菌感染后激活黏膜、血清系统，从而导致抗体、体外T淋巴细胞反应和相关细胞因子的产生[5]。Th1 型 CD4+T 细胞的适应性免疫和下游细胞因子反应被认为是抵抗黏膜念珠菌的主要宿主防御机制感染,其中IL-2、TNF-α、IFN-γ由 Th1 细胞释放，介导细胞免疫应答；IL-4、IL-10 由 Th2 类细胞分泌，介导体液免疫反应，Th2细胞会抑制Th1介导的保护作用，从而导致对念珠菌感染的易感性[14]。徐友红等[22]研究表明，霉菌性阴道炎患者 Th1型细胞因子在反应机制下呈低表达，而Th2型细胞因子则呈现高表达，通过抗真菌制剂的干预治疗之后，霉菌性阴道炎患者Th1/Th2等细胞免疫指标均得到明显改善。

相关研究认为乳酸杆菌给药在维持免疫稳态，通过调节细胞因子的上皮分泌抑制上皮促炎性细胞因子的释放，降低Th1/Th2细胞比(IFN-γ/IL-4)起到了不可或缺的作用，同时增加上皮衍生的IgG表达[23,24]。之前有体外研究表明，乳杆菌在体外减弱了白色念珠菌的毒力，调节细胞因子和趋化因子的分泌(IL-2、4、6、8 和 17)，增强了阴道上皮细胞的免疫反应[25]。本研究结果显示，初次治疗后3个月，两组患者分泌物及外周血中Th1、Th2相关细胞因子失衡状态均有所恢复，免疫细胞水平也有所改善，且观察组优于对照组。提示联合乳杆菌用药可有效改善外周血及阴道分泌物的T淋巴细胞和细胞因子水平，加强Th1反应，降低Th2反应，其机制可能为乳杆菌增强阴道上皮细胞的免疫功能并减弱假丝酵母菌的毒力，并且可能促进了阴道黏膜在针对真菌病原体的局部免疫反应中起作用，从而降低假丝酵母菌的易感性和炎性反应，进一步降低了复发率。

综上所述，本研究结果表明，与单独使用氟康唑治疗比较，采用氟康唑联合乳酸杆菌阴道用药治疗RVVC疗效更好，该疗法可明显的调节机体免疫力、降低复发率，提高治愈率和患者生活质量。虽然本研究存在随访时间不足、样本量小、仅为单中心研究等缺陷，但仍为该病的临床用药方案的改进、抗真菌药物、免疫治疗等相关深入的研究提供了一定的研究基础，具有临床推广意义。