壮方柔肝化纤颗粒对CCl4复合因素诱导肝纤维化大鼠模型的干预效应及其对α-SMA、E-Cadherin 表达的影响

张文富，吴姗姗，戴 铭，吕建林，黄晶晶，李晓龙，王振常2，

（1.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，广西 南宁530299；3.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；4.广西中医药大学，广西 南宁 530299；5.广西中医基础研究重点实验室，广西 南宁 530299；6.广西医科大学，广西 南宁 530021）

肝纤维化是病毒性肝炎、酒精性肝病等各种慢性肝病进展的必经过程，同时也是进展为肝硬化，甚至是肝癌的关键环节。早期抗纤维化干预治疗，可有效改善甚至逆转肝纤维化，并在一定程度上降低肝硬化与肝细胞癌的发病概率，延长患者寿命。研究证实，氧化应激反应机制在各类慢性肝脏疾病的起始和进展过程中均起着关键作用［1，2］。氧化应激反应系统的激活可导致众多炎症因子的释放［3］，而炎症因子的大量释放不仅会导致炎症的一系列连锁反应，还能造成氧化应激系统的激活，继而加重肝纤维化与肝硬化程度［4］，相反，抑制氧化应激与减轻炎症反应可以在一定程度上减轻甚至逆转肝纤维化［5，6］。因此，降低氧化应激与肝纤维化、肝硬化的发生发展密切相关［7］。国内外研究显示，一些中药单体或中药复方能有效改善甚至逆转肝纤维化患者肝组织病理学进程［8-13］。经国家级第一批名老中医林沛湘教授对肝病多年研究总结的“壮肝逐瘀煎”与全国首批名老中医关幼波教授多年来用于治疗肝纤维化、肝硬化有效验方化裁而成的壮方柔肝化纤颗粒，由生黄芪、生牡蛎、老虎姜、枸杞子、薏苡仁、芸红、地瓜苗、上甲、虎杖、鸡黄皮、大枣等十一味药组成，有攻毒补虚之功效，使壮医理论之“气道”、“谷道”、“水道”三道通畅。前期研究已证实柔肝化纤颗粒可改善肝纤维化、肝硬化、肝癌患者的临床症状［14-16］，有助于乙肝肝硬化患者利尿消肿与减少腹水的生成［17］，但其作用机制尚未明确。本研究采用CCl4联合花生油复合溶液联合诱导肝纤维化大鼠，剖析柔肝化纤颗粒对肝纤维化大鼠的干预效应，以本团队前期临床研究的氧化应激水平为切入点，深入探讨柔肝化纤颗粒抗肝纤维化的作用效应，为柔肝化纤颗粒治疗肝纤维化提供切实可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取体重100～120 g 的SPF 级健康雄性Wistar 大鼠48 只，均购买于广西医科大学实验动物研究所。饲养室温度设定值为19.2 ℃，相对湿度设定值为49.8%，压力设定值为0.9 Pa，送风风速目标值为7.1 m/s，排风风速目标值为3.6 m/s，换气次数目标值为70 次/h，风量比例目标值为50%，光照时间与黑暗时间对等，常规环境适应性喂养7 d，期间由大鼠自主饮水与进食。实验动物生产许可证号：SCXK 桂2020-0003；实验动物使用许可证号：SCXK 桂2020-0004。

1.1.2 试剂耗材 环保型浸蜡脱蜡透明液（南昌雨露实验器材有限公司，200801），脱水剂Ⅰ（75%乙醇）（南昌雨露实验器材有限公司，200801），脱水剂Ⅱ（85% 乙醇）（南昌雨露实验器材有限公司，190604），脱水剂Ⅲ（95%乙醇）（南昌雨露实验器材有限公司，191101），脱水剂Ⅳ（无水乙醇）（南昌雨露实验器材有限公司，200901），苏木精染液（南昌雨露实验器材有限公司，191202），无毒环保苏木素-伊红（HE）染色液（南昌雨露实验器材有限公司，200901），中性环保速干胶（南昌雨露实验器材有限公司，180502），无毒环保马松（Masson）三色染色液（Solarbio，G1340），PBS 缓 冲 液 干 粉（Solarbio，P1010），EDTA 抗 原 修 复 液（50X）（Solarbio，C1034），30%过氧化氢（成都金山化学试剂有限公司，20190608），山 羊 血 清（Beyotime，C0265），α-SMA Polyclonal Antibody（Elabscience，E-AB-34268），E-Cadherin Polyclonal Antibody（Proteintech，20874-1-AP），Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（abcam，ab6721），DAB 显色液（中杉金桥，ZLI-9018），CCl4（中国医药集团上海化学试剂公司，20210218），ALT、AST 检测试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司，20210822，20210912），α-SMA免疫组化试剂盒（中杉金桥，ZM-0003），E-Cadherin免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，2105190738b），超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（吉林百奥生物科技有限公司，9054-89-1），丙二醛（MDA）测试盒（吉林百奥生物科技有限公司，XF03124B）。

1.1.3 药物 壮方柔肝化纤颗粒，由壮方柔肝化纤颗粒，由生黄芪45 g、生牡蛎30 g、老虎姜20 g、枸杞子20 g、薏苡仁45 g、芸红12 g、地瓜苗30 g、上甲30 g、虎杖20 g、鸡黄皮15 g、大枣15 g 组成。所选取的药物为免煎颗粒（江阴天江药业有限公司生产），由广西国际壮医医院药学部中心药房提供，入库的所有中药依据2020 年版《中华人民共和国药典》第一部内容鉴定，选取道地药材，符合中国药典标准。

1.1.4 器材 赛默飞世尔脱水机（英国赛默飞，Excelsior AS），莱卡组织切片机（上海莱卡，2235），莱卡组织摊片机（上海莱卡，HI1210），莱卡组织烤片机（上海莱卡，HI1210），一恒电热干燥箱（上海一恒，DHG-9091A），恒温培养箱（上海申贤，DHP-90052），通风柜（广州汇绿，630），霉菌培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司，MJ-150-Ⅱ）；普通PCR 仪（Bio-RAD，T100）；实时荧光定量PCR 仪（RT-PCR）（杭 州 安 誉AGS8830-16）；电 泳 仪（Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra System），光学显微镜（日本奥林巴斯，BX-53）；化学发光凝胶成像分析系统（日本奥林巴斯，U-RFL-T）。

1.2 方法

1.2.1 分组 根据采取随机数字表法，将48 只Wistar 大鼠随机分为空白组、病理模型组与柔肝化纤颗粒组，每组均为16 只。

1.2.2 造模与给药 病理模型组与柔肝化纤颗粒组Wistar 大鼠采取皮下注射40%的CCl4联合花生油复合因素诱导下，对其进行诱导肝纤维化实验操作。动物造模方法参照马学惠［18］与吕艳杭［19］法规范操作，第一次皮下注射5 mL/kg，之后间隔3 天以每3 mL/kg 的标准进行皮下注射，每周注射2 次，连续8 周。并且每天予高脂、低蛋白辅食（予玉米面为日常基础食物，在第1、第2 周添加予0.5%胆固醇与20%猪油）喂养，为了充分而有效避免大鼠肝纤维化模型的自然恢复从而对实验结果准确性造成的不良影响，造模成功后仍按3 mL/kg 的标准每周皮下注射一次40% CCl4油剂；空白组除了正常喂养以外，在相同时间皮下注射等剂量花生油，8 周后按照8 mg/kg 的标准给予生理盐水灌胃。造模成功后，中药使用剂量参照Wojcikowski Ken［20］动物用药剂量的换算方法实施，病理模型组给予8 mg/kg 生理盐水灌胃，柔肝化纤颗粒组给予该中药方的颗粒溶液同样按8 mg/kg 的剂量进行灌胃，每周灌胃3 次，连续8 周。

1.2.3 标本采集 按照造模与给药方法对Wistar大鼠进行药物干预第8 周末当晚，各组大鼠均禁食但不禁水12 h，予1%戊巴比妥注射液（5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，10 min 后对大鼠进行夹尾试验，不动弹方可判断为麻醉起效。在大鼠躯干前面腹部正中间按“T”字形状小心剪开，完整显露出腹主动脉后进行采血，采血完毕后将血液静置于室温1 h，静置后，于3000 r/min，按照离心半径参数为10 cm的设置，离心15 min。采用移液枪吸取血清，取大鼠肝组织标本开展下一步操作。

1.2.4 肝功能转氨酶水平检测 严格参照ALT 与AST 检测试剂盒说明书中的操作步骤进行，检测三组大鼠血清 ALT、AST 指标。

1.2.5 肝组织病理切片制备 充分选取大鼠肝组织中右叶最厚处，切取标本约0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm 肝组织1 块，将选取的肝组织放入4 %的多聚甲醛溶液中固定12 h，采用自动脱水机连续4 次进行逐级酒精脱水，将组织浸入于二甲苯溶液中透明组织，再使用石蜡将组织充分包埋，采用切片机将石蜡包埋组织切成4 μm 厚的切片，放置在干净的载玻片上，然后将其置于60 ℃的恒温箱中孵育，5 h 后将其取出，放于4 ℃冰箱中保存进行后续实验。

1.2.6 HE 染色 使用二甲苯脱蜡10 min，结束后将其充分冲洗后使用苏木精有效染色，时间约4～6 min，根据实际染色情况适当增加或缩短染色时间，使用流动水冲洗干净苏木精溶液，使用分化液将组织分化后再用流水冲洗组织，滴加少量乙酸至铺满载玻片上的组织为宜，组织分化结束后颜色逐渐变浅为蓝色，再将其放入0.1%氨水水溶液中返蓝，直至变成蓝色后流水冲洗，观察着色情况，细胞核呈蓝黑色后，0.5%伊红染色再冲洗，观察着色情况，细胞浆着色呈粉色后，放入75%、85%、95%、100%酒精中脱水，晾干后置于二甲苯中，晾干后滴上中性树胶封片。

1.2.7 Masson 染色 二甲苯脱蜡，冲洗后苏木素染色，冲洗后再用5%乙酸分化，冲洗并滴加乙酸，组织分化结束后颜色逐渐变浅成蓝色，再使用Masson蓝化液对组织进行返蓝，采用光学显微镜观察组织染色结果，被着色的细胞核部位呈现出蓝黑色，再将以上组织置于Masson 丽春红酸性品红液中进行充分染色，接着使用乙酸水溶液进行冲洗，然后使用磷钼酸水溶液再次将其分化，按照蒸馏水与弱酸溶液比例为2∶1 的方法进行配置弱酸工作液有效冲洗，采用苯胺蓝染色液进行二次染色，工作液冲洗后脱水晾干并放在二甲苯中透明3 次，最后将其自然晾干再用中性树胶封片。

1.2.8 免疫组化 将组织先进行脱水处理，包埋，待蜡块完全凝固后存放备用。组织切片，厚度为3 μm，捞片，65 ℃烤片过夜。切片常规脱蜡至水，依次放入脱蜡液Ⅰ、脱蜡液Ⅱ、脱蜡液Ⅲ、无水乙醇、95%乙醇、85%、75%乙醇、自来水中清洗。洗片，EDTA 抗原有效修复，3%H2O2室温充分孵育15 min，洗片以阻断内源性过氧化物酶，5%正常山羊血清涂覆样本，置于湿盒中37 ℃封闭1h。进行一抗孵育时，采用封闭液稀释好的α-SMA 抗体（1∶200）或E-Cadherin 抗体（1∶1 000）滴在载玻片上铺满组织，4 ℃孵育过夜。进行二抗孵育时，37 ℃孵育30 min 再洗片。加入DAB 显色液，在显微镜下控制显色，苏木素复染细胞核，冲洗返蓝，依次脱水再风干，中性树胶封片，光学显微镜下镜检。

1.2.9 ELISA 严格参照SOD ELISA 试剂盒与MDA ELISA 试剂盒说明书步骤进行，检测各组大鼠的SOD 与MDA 指标。

1.2.10 RT-PCR 测定肝组织α-SMA mRNA、E-Cadherin mRNA 表 达 称 取100 mg 大 鼠 肝 脏 标本，根据Trizol 法提取总RNA，总反应体系为20 μL，将其置入42 ℃水浴1 h，充分逆转录为第一链cDNA。选用所得逆转录产物1 μL 作为提取的反应模板，反应体系为25 μL。扩增条件设置参数为：94 ℃预变性5 min，接着94 ℃变性40 s，然后60 ℃退火40 s，接着72 ℃延伸1 min，连续35 个循环，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。β-action 内参扩增设置参数为：94 ℃预变性5 min，接着94 ℃变性40 s，然后60 ℃退火40 s，接着72 ℃延伸1 min，连续32 个循环，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃冰柜保存。将5 μL PCR 产物进行凝胶电泳，摄像、存储并分析。引物设计见表1。

表1 引物设计Tab 1 Primer design

1.2.11 蛋白质印迹分析（Western Blot）使用电子天平称取40 mg 大鼠肝组织，于10 mL 的裂解液中加入蛋白酶抑制剂，冰盒上裂解，研磨匀浆，低速离心，取上清液，即得肝组织总蛋白。使用大鼠BCA蛋白ELISA 试剂盒，测定总蛋白浓度后，对蛋白进一步电泳、转膜、封闭等相关操作，使用β-微管蛋白作为内参，按增强化学发光法对其进一步曝光显影成像，分析目的蛋白条带和内参的灰度值比值，采用GeneTools 图像分析管理系统对其进行半定量分析并储存。

1.3 统计学处理

本实验研究运用SPSS 27.0 统计学软件对数据进行系统比较分析，鉴于本实验结果所比较的计量资料为独立样本，且所得实验数据符合统计学正态分布，所以两组数据间相比的计量资料予采用t 检验，组间的比较予采用独立样本t检验。在符合独立样本、正态性分布且方差齐的情况下，多组间相比较采用单因素方差分析（F检验）。方差不齐时，采用均值相等性的键壮性检验。采用双侧检验以再次验证本研究数据的准确性，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。数据图形处理采用Graphpad Prism 9.0 软件进行。

2 结果

2.1 柔肝化纤颗粒治疗CCl4复合因素诱导肝纤维化大鼠肝损伤情况

经柔肝化纤颗粒干预后，病理模型组与空白组大鼠相比较，病理模型组大鼠肝功能ALT、AST 两个指标值均显著升高（P均＜0.001）；但柔肝化纤颗粒组与病理模型组大鼠相比，ALT、AST 两个指标值均明显降低（P均＜0.001）。见表2。

表2 各组大鼠血清转氨酶指标比较（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠血清转氨酶指标比较（±s）Tab 2 Comparison of serum transaminase indexes of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与病理模型组比较，▲P＜0.01。

指标ALT（U/L）AST（U/L）空白组（n=16）55.16±3.53 179.25±28.51病理模型组（n=16）225.29±69.09*317.30±82.88*柔肝化纤颗粒组（n=16）159.12±52.80▲219.64±56.75▲FP＜0.001＜0.001 46.62 22.18df20.14 25.42

2.2 HE 染色结果

光镜下显示（图1）：空白组大鼠肝小叶结构排列完整有序，肝细胞大小与形态表现正常，肝细胞索均匀围绕中央静脉呈放射状有一定规律地排列，未见出现肝细胞脂肪变性及肝脏纤维组织增生，可见极少量炎细胞轻度浸润。病理模型组大鼠肝组织内的小叶结构已残缺，出现众多肝脏纤维组织异常增生，增生所形成的胶原纤维汇合成密集的纤维间隔，从而变成假小叶结构，假小叶结构内部出现大量形态各异、大小不均的脂肪变性的肝细胞，炎症细胞弥漫性浸润显著。与病理模型组相比，经过干预后的柔肝化纤颗粒组肝小叶结构被破坏的面积显著减少，正常肝小叶结构增多，有不同程度增生的胶原纤维组织出现在中央静脉至汇管区，纤维间隔相对疏松，有少量炎症细胞浸润，浸润程度较病理模型组减轻。

图1 各组大鼠肝组织HE 染色结果（×400）Fig 1 HE staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.3 Masson 染色结果

光镜下显示（图2）：空白组大鼠肝组织肝小叶结构清晰可见，细胞排列正常有序，仅在中央静脉区域的血管壁附近可见少许蓝色胶原纤维稀疏排列。病理模型组大鼠肝组织清晰显示出众多异常增生的蓝色胶原纤维，不规律包围环绕、分隔肝小叶组织，形成大小不等的假小叶结构。柔肝化纤颗粒组大鼠肝组织亦可见蓝色胶原纤维出现在汇管区域内，纤维细薄，从中央静脉向四周延伸蔓延，胶原纤维增生较病理模型组有很大程度的减轻。

图2 各组大鼠肝组织Masson 染色结果（×400）Fig 2 Masson staining results of liver tissue of rats in each group（×400）

2.4 免疫组化结果

α-SMA 蛋白表达以细胞质为主，着色为棕黄色。光镜下显示，大鼠肝组织中α-SMA 仅可见少量表达，仅存在于汇管区小动脉与小静脉血管壁上，其余组织区域未发现明显表达。病理模型组大鼠肝组织中α-SMA 呈强阳性高表达状态，在汇管区与胶原纤维增生处清晰可见其大量密集分布，并且在假小叶及增生的纤维间隔内可见大量α-SMA 表达。柔肝化纤颗粒组大鼠肝组织α-SMA 少量表达于汇管区血管壁、纤维间隔中，肝窦处亦有少许分布，表达的强度及范围较病理模型组显著减少（图3）。E-Cadherin 阳性染色显示区域主要定位于细胞膜上，一般着色为棕黄色。光镜下，大鼠肝组织E-Cadherin 呈高表达，病理模型组大鼠肝组织E-Cadherin 呈低表达或缺失，柔肝化纤颗粒组大鼠肝组织E-Cadherin 表达较模型组有不同程度的升高（图4）。

图3 各组大鼠肝组织α-SMA 免疫组化结果（×400）Fig 3 Liver tissue of rats in each group α- SMA immunohistochemical results（×400）

图4 各组大鼠肝组织E-Cadherin 免疫组化结果（×400）Fig 4 Immunohistochemical results of E-cadherin in liver tissue of rats in each group（×400）

2.5 ELISA 结果

SOD 与MDA 是氧化应激的重要指标。经柔肝化纤颗粒干预后，柔肝化纤颗粒组SOD 水平较病理模型组明显升高（P＜0.001）。柔肝化纤颗粒组MDA 水平较病理模型组明显下降（P＜0.001）。见表3，图5。

图5 各组大鼠肝组织SOD 与MDA 水平比较Fig 5 Comparison of SOD and MDA levels in liver tissue of rats in each group

表3 各组大鼠氧化应激指标比较（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠氧化应激指标比较（±s）Tab 3 Comparison of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.01。

指标FP空白组（n=16）病理模型组（n=16）柔肝化纤颗粒 组（n=16）dfSOD（IU/mL）MDA（nmol/L）542.75±69.46 297.72±60.45 162.20±21.73*1 095.13±185.76*398.45±66.05▲671.54±180.84▲＜0.001＜0.001 183.40 107.82 23.50 23.66

2.6 RT-PCR 与Western Blot 结 果

柔肝化纤颗粒组大鼠肝组织中α-SMA 的表达水平较病理模型组明显下降（P＜0.001）。柔肝化纤颗粒组大鼠肝组织中E-Cadherin 的表达水平较病理模型组明显升高（P＜0.001）。

图6 α-SMA、E-Cadherin 的表达Fig 6 Expression of α-SMA and E-Cadherin

3 讨论

肝纤维化的诱因是形式多样的，发病机制错综复杂［21］，形成过程也多样化。中医辨证认为［22，23］，肝纤维化的中医病机为“虚、瘀、毒”。研究证实［24-30］，有些中药单品及中成药有保肝护肝的作用，在一定程度上可产生抗肝纤维化的疗效。壮方柔肝化纤颗粒的主要功效是“攻毒补虚”，对辩证治疗肝纤维化的病因病机是相符的，前期研究已证实［14-17］，此方对肝纤维化、肝硬化、腹水等慢性肝病及其并发症有显著的疗效，但其作用机制尚未明确。

很多病因可以直接或间接导致肝纤维化，氧化应激反应就是其中一种常见的病因。研究显示［31-33］，氧化应激系统的激活可致使众多炎症因子的释放，其是肝纤维化形成的常见病理生理变化之一，而大量炎症因子的不断释放既可诱发炎症反应，又能引起氧化应激系统的激活，继而使肝纤维化程度加重，并逐步向肝硬化进展。氧化应激系统是引起肝脏损伤与导致肝纤维化、肝硬化的重要因素之一。同样，形式多样的发病诱因亦可激活氧化应激系统，因此，减轻氧化应激系统的过分活跃是抑制肝纤维化程度的有效控制措施。国内外多方面研究证实［34-38］，肝星状细胞（HSC）的增殖及活化是肝纤维化、肝硬化进程的关键环节，肝纤维化的不断分化可加重成肝硬化，甚至恶变成肝癌，所以减缓或逆转肝纤维化的进程是防治肝硬化与肝癌必 不 可 少 的 环 节［39，40］。而SOD 作 为 机 体 代 谢 中 氧化物自由基最关键的歧化酶之一，不仅对活化的HSC 产生巨大影响，还能导致多系统激活从而减少肝细胞凋亡［41，42］：主要体现在SOD 活跃程度减退后导致脂质过氧化物在多种金属离子产物与酶活性的作用下分化降解，使MDA 分泌过盛，MDA 对细胞产生毒性，从而跟蛋白质分子进行交联，进一步诱发肝细胞凋亡［43，44］。为此本研究通过探索壮方柔肝化纤颗粒干预CCl4肝纤维化大鼠模型，剖析柔肝化纤颗粒在抗肝纤维化病理进展中所发挥的效应及其作用机制。本研究结果显示，CCl4复合因素诱导的肝纤维化模型组Wistar 大鼠血清的 ALT、AST 等指标水平明显升高，通过柔肝化纤颗粒干预后转氨酶能有效下降，表明柔肝化纤颗粒可通过保护大鼠肝功能而起到防治肝损伤的作用。HE 染色、Masson 染色与免疫组化结果提示柔肝化纤颗粒可有效减轻CCl4复合因素诱导的模型大鼠的肝细胞损害情况，减轻其肝组织炎症程度，逆转其肝纤维化进程。ELISA 结果显示柔肝化纤颗粒组SOD水平较病理模型组与空白组明显升高（P＜0.001），柔肝化纤颗粒MDA 水平较病理模型组明显下降（P＜0.001），证实了柔肝化纤颗粒的有效性，其作用机制与保护肝功能、降低氧化应激水平密切相关。

HSC 激活后能加速肝纤维化主要以α-SMA 的表 达 升 高 作 为 重 要 判 定 指 标 之 一［45，46］。α-SMA 是HSC 活化增殖的关键病理学标志和特异性蛋白，α-SMA 的过度表达能加速HSC 过度分泌ECM，从而促使肝纤维化的发生与发展，还能间接反映出HSC 在机体内活化增殖的进度与纤维化进展的严重程度［47］。α-SMA 表达水平升高后可直接加速肝纤维化与肝损伤的进程，还能作为评估肝硬化进展程度的重要指标。本研究表明，经CCl4复合因素诱导的肝纤维化大鼠的α-SMA 表达水平显著升高，经过柔肝化纤颗粒干预后，α-SMA 的表达水平与病理模型组相比显示出明显下降的分布（P＜0.001），说明柔肝化纤颗粒可抑制HSC 的活化增殖，对肝纤维化有一定的抑制效果。E-cadherin 是肝病的血清生物标志物［48］，是一种钙依赖的、能够维持上皮组织稳定的钙粘蛋白，在组织分化中形成稳定的黏附带［49］，若其不能充分表达，则上皮细胞间的结构发生紊乱，上皮细胞进一步发生EMT 而影响细胞的正常代谢，从而转变为间质细胞。EMT 的中心环节是E-cadherin 的过度抑制，EMT 发生时上皮细胞原有功能也随之发生变化，产生运动与迁移的改变，向间质细胞进一步转化。发生EMT 时，组织细胞上皮标志成分E-cadherin 表达明显受到抑制，间质细胞标志成分神经型钙黏附蛋白（neurotype cadherin，N-cadherin）与α-SMA 表达升高，E-cadherin 的表达水平能反映出肝纤维化的程度，其表达水平越低，说明肝纤维化水平越重［50］。TGF-β1/Smad 信号传导通路是HSC 活化与增殖的关键通路［51-53］，TGF-β1 是肝纤维化进程中诱发EMT 的环节上其关键作用的细胞因子。通过影响TGF-β1/Smad 信号通路的传导，在细胞核内诱导调控转录因子SRC-1、Twist 的过分表达，继而促使HSC 向EMT进展［54］。本研究表明，与空白组比较，肝纤维化模型组α-SMA mRNA 表达水平显著增高，E-cadherin mRNA 表达明显下降。与病理模型组相比，柔肝化纤颗粒组α-SMA mRNA 表达水平显著降低，E-cadherin mRNA 表达水平明显增高，提示柔肝化纤颗粒可能通过减轻EMT 的发生从而发挥抗肝纤维化的作用。

综上所述，柔肝化纤颗粒能有效抑制肝纤维组织增生，降低CCl4联合花生油复合溶液联合诱导肝纤维化大鼠血清的ALT、AST 水平，其抗肝纤维化机制可能是通过保护肝功能、降低氧化应激水平、下调α-SMA 蛋白的表达、上调E-cadherin 蛋白的表达、抑制细胞EMT 从而对CCl4复合因素诱导肝纤维大鼠化发挥治疗作用。

所有作者声明不存在利益冲突关系。