通利枢机针刺法通过Notch通路对脑卒中后肢体痉挛大鼠肢体功能及神经功能的影响*

冉鹏飞，王艳敏，关晓蕾，张雅素

1.平顶山市第一人民医院，河南 平顶山 467000； 2.平顶山市中医医院，河南 平顶山 467000； 3.河南中医药大学，河南 郑州 450046

流行病学研究显示，全世界每年约有1 500万新发脑卒中患者，而我国每年新发病例约150～200万，且每年以9%的发病速度上升，约70%～80%脑卒中患者会遗留不同程度功能障碍[1]，其中以肢体痉挛最为常见，痉挛可阻碍机体运动功能重建，影响神经功能恢复，是脑卒中康复治疗的重难点[2]。近年，中医疗法在脑卒中恢复中显示出独特治疗价值，气血逆乱、上犯于脑是其主要病机，而针刺可通过辨证取穴刺激促进脑损伤恢复，受到国内外学者认可[3-5]。中医依据“少阳主枢”理论提出通利少阳枢机法防治中风相关性疾病，研究发现，其可提高患者活动能力与生活质量[6-7]。研究证明，Notch通路与神经损伤性疾病密切相关，可调控神经细胞分化、存活、凋亡等，在神经发育、再生中起决定作用[8]。基于此，本研究以Notch通路为切入点，探讨通利枢机针刺法对脑卒中后肢体痉挛大鼠神经与肢体功能的改善作用及其机制，为脑卒中后肢体痉挛的治疗提供实验依据与理论基础。

1 材料

1.1 动物SPF级SD雄性大鼠80只，体质量 260～300 g，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005，自由饮水摄食，灭菌型饲料适应性喂养1周，饲养温度21～25 ℃，湿度30 %～33 %，每3日更换垫料1次，12 h昼夜循环照明，实验操作符合平顶山市第一人民医院动物伦理学批准，伦理批号：20200312。

1.2 药品与试剂N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR，上海远慕生物科技有限公司，货号：YM-kk9079)；DAPT(γ-分泌酶抑制剂，分子式：C23H26F2N2O4，美国Sigma-Aldrich公司，货号：D5942-5MG)；γ-氨基丁酸a型((γ-aminobutyricacid type A，GABAa)、γ-氨基丁酸转运体(γ-aminobutyric acid transporter-1，GAT-1)、Notch1、Jagged1、β-actin抗体(美国Abcam公司，货号：ab229678、ab177483、ab167441、ab85763、ab50599)。

1.3 仪器SLY-B型四道生理记录仪(上海康为医疗科技发展有限公司)；DYCZ-40D型转印电泳仪(武汉纯度生物科技有限公司)；Q1600型实时荧光定量PCR仪(杭州柏恒科技有限公司)；GenoSens 1860型凝胶成像分析系统(上海臻诺生物科技有限公司)；HFJ-8(10)型内切式匀浆机(天津市恒奥科技发展有限公司)；一次性无菌针灸针(规格：0.25 mm×25.00 mm、0.25 mm×13.00 mm，河南泽垣医疗器械销售有限公司)。

2 方法

2.1 分组、建模与干预80只大鼠适应性饲养1周后，取12只为对照组，12只为假手术组，其余56只大鼠采用Zea Longa线栓法与内囊注射NMDAR法建立脑卒中后肢体痉挛模型[9]，具体如下，建立脑卒中模型(Zea Longa线栓法)：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧位绑缚于手术台，备皮、消毒、铺巾，于颈项部正中偏右做切口，钝性分离右侧颈总动脉、迷走神经，暴露颈总动脉分叉处、颈外动脉、颈内动脉，在颈总动脉远心端、颈外动脉近心端使用6-0线结扎，动脉夹夹闭颈内动脉，阻断血流；颈总动脉分叉(膨大5 mm)处剪“V”型切口，栓线插入颈内动脉，打开动脉夹，当进线约18～20 mm稍感阻力处停止插线，颈内动脉近心端及栓线一同结扎，缝合切口；术后常规抗感染、防脑水肿，单笼喂养，保证大鼠呼吸通畅。Zea Longa评分1～3分说明模型成功。建立肢体痉挛模型(内囊注射NMDAR法)：脑卒中模型建立后的第2天，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后将内含5 μL NMDAR的微量注射器缚于脑立体定位仪上，消毒铺巾后沿大鼠颅顶矢状缝做切口(1.5～2 cm)，逐层分离皮肤组织等，暴露前囟，拉开局部组织以暴露右侧额骨、顶骨交界骨缝，定位内囊位置(矢状缝偏右侧2.4 mm、前囟偏后1.4 mm)，记号笔标记，钻孔，以破开颅骨为深度标准，微量注射器垂直插入(7 mm)，缓慢注射5 μL NMDAR(注射时间5 min)，拔出微量注射器，明胶海绵压迫止血，消毒，缝合切口，改良版Ashworth量表评定1～4级表明模型成功。假手术大鼠仅分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，不结扎、不插线，内囊注射5 μL生理盐水，其余同上。对照组大鼠不做任何处理。在造模过程中，5只大鼠因神经功能严重受损剔除，3只大鼠因血管破裂出血剔除，2只大鼠因呼吸道炎症反应死亡剔除，将剩余46只造模成功大鼠分为模型组(n=11)、DAPT组(n=11)、针刺组(n=12)、针刺+DAPT组(n=12)。针刺组大鼠于术后第1天开始针刺治疗，参照动物穴位结合人体同身寸取穴进行定位，左侧天井穴直刺5 mm，左侧正营穴平刺 5 mm，左侧环跳穴直刺10 mm，留针15 min，留针期间，间隔5 min施展1次平补平泻手法，每次 10 s，每日针刺1次，共持续2周；DAPT组大鼠以 0.1 mg·kg-1剂量进行腹腔注射，每日1次，持续2周；针刺+DAPT组干预手段同上述针刺组、DAPT组；假手术组、模型组大鼠在相同时间仰卧位固定于鼠板上，不进行针刺治疗，腹腔注射生理盐水，时间同上；对照组大鼠不捆绑、不治疗。

2.2 神经功能评估干预2周结束后，采用Zea Longa评分评估各组大鼠神经功能，评分标准如下，0分：活动正常，无神经损伤症状；1分：不能完全伸展患侧前爪，轻微神经功能受损；2分：向外侧转圈，中度神经受损；3分：向患侧倾倒，重度神经受损；4分：无法自发行走，意识明显下降或丧失；5分：死亡。

2.3 肢体功能检查评估神经功能后采用Feeney平衡木评分[10]评价大鼠肢体功能，在距离地面高 10 cm 处放置长80 cm、宽2.5 cm的平衡木，观察大鼠在平衡木上的状态，评分如下，0分：能跳上平衡木，能行走，不跌倒；1分：能跳上平衡木，能行走，跌倒几率<50%；2分：能跳上平衡木，可行走，跌倒几率≥50%；3分：在健侧后肢支持下可跳上平衡木，患侧后肢无法让大鼠移动；4分：可坐于平衡木上，但不能行走；5分：放在平衡木上会掉下来。

2.4 肌张力评估神经、行为评估结束后，使用电生理描记结果评估肌张力。各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠浅度全麻后，使用四道生理记录仪测定大鼠肌张力，测定方法：一端点击插入左后肢股四头肌，另一端插入尾部，于左后肢下端系低顺应性棉线，将棉线通过张力传感器与生理记录仪相连，定时刺激股四头肌，刺激时间10 s，刺激量3 mA，据此产生的电信号反映肌张力变化，肌张力越低，刺激痉挛肢体被动运动幅度越大，描记电信号越高。

2.5 RT-PCR检测Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA的表达水平上述检测完成后处死大鼠，快速取出大鼠脑组织，置于冻存管，冻存管液氮降温1 d，-80 ℃环境冻存，待测。RT-PCR操作步骤如下：①提取总RNA，加入裂解液，内切式匀浆机匀浆，温育，添加氯仿、异丙醇、乙醇(体积分数75%)后离心，40 μL DEPC水溶解提取RNA；②cDAN合成，剔除总RNA中的DNA、DNase 1，反转录cDNA；③扩增，PCR反应程序为95 ℃预变性 60 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸、采集荧光30 s，共进行40个循环；④以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法评估PCR产物的表达水平。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

2.6 Western Blot测定Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1的蛋白表达水平研磨大鼠脑组织，加入裂解液，匀浆至裂解充分，4 ℃ 15 000 r·min-1离心15 min，取酶标板，依次添加试剂，各孔加入BCA工作液，振荡30 s，562 nm下测吸光度，绘制标准曲线，完成蛋白定量；制备SDS-PAGE胶，取样品蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳分离后转膜至PVDF膜，转膜时间2 h，电流380 mA，TBST配置5 %脱脂牛奶，封闭1 h，加一抗(稀释比例12 000)4 ℃孵育过夜，第二日复温，TBST液漂洗3次，每次 10 min，加二抗(稀释比例15 000)常温孵育1 h，漂洗3次，β-actin为内参，显影定影，采用凝胶图像处理分析系统对蛋白条带灰度值进行处理统计。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能比较对照组、假手术组大鼠Zea Longa评分为0，神经功能正常。与对照组、假手术组比较，模型组及DAPT组大鼠Zea Longa评分显著升高(P<0.05)；与模型组、DAPT组比较，针刺组、针刺+DAPT组大鼠Zea Longa评分显著降低(P<0.05)；与针刺组比较，针刺+DAPT组大鼠Zea Longa评分显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠神经功能评分比较 分)

3.2 各组大鼠肢体功能与肌张力比较对照组、假手术组大鼠肢体功能与肌张力正常。与对照组、假手术组比较，模型组及DAPT组大鼠Feeney平衡木评分显著升高(P<0.05)；与模型组、DAPT组比较，针刺组、针刺+DAPT组大鼠Feeney平衡木评分显著降低(P<0.05)，电生理描记结果显著升高(P<0.05)；与针刺组比较，针刺+DAPT组大鼠Feeney平衡木评分显著升高(P<0.05)，电生理描记结果显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肢体功能与肌张力水平比较

3.3 各组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1mRNA表达水平比较与对照组、假手术组比较，模型组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAamRNA表达水平显著降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，针刺组、针刺+DAPT组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAamRNA表达水平显著升高(P<0.05)，GAT-1mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与针刺组比较，针刺+DAPT组大鼠脑Notch1、Jagged1、GABAamRNA表达水平降低(P<0.05)，GAT-1mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1 mRNA表达水平比较

3.4 各组大鼠脑组织中Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表达水平比较与对照组、假手术组比较，模型组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，GAT-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，针刺组、针刺+DAPT组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，GAT-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与针刺组比较，针刺+DAPT组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表达水平显著降低，GAT-1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表5、图1。

表5 各组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白表达水平比较

注：A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：DAPT组；E：针刺组；F：针刺+DAPT组图1 各组大鼠脑组织Notch1、Jagged1、GABAa、GAT-1蛋白条带图

4 讨论

现代医学研究发现，脑卒中后肢体痉挛本质是脑卒中发病后高级中枢受损，引起下位中枢运动神经元抑制或减弱，干扰大脑下位中枢调控，脊髓前角运动神经元因神经递质易化作用兴奋性增高，出现肢体痉挛，以肢体活动受限、挛缩变形等为主要表现，严重降低生活质量[11-12]。改善脑卒中患者神经功能、纠正异常肢体功能障碍，是脑卒中后恢复的首要目标[13-15]。

国内外研究学者证实[16-18]，针刺疗法在脑卒中及脑卒中后功能障碍性疾病中均取得确切效果。中医认为，机体内部阳气于表里之间，如枢机一般，可入可出，升降出入自如，则枢机气血运行通顺，阴阳协调，开阖有度[19-20]；而三焦统领五脏六腑、经络、荣卫之气，三焦通则枢机通、气血经络通，手少阳三焦经疏风行气、开窍解郁，足少阳胆经疏肝利胆通窍，故手足少阳经脉对枢机运行顺畅、全身经络协调有关键作用[21-22]。本研究成功构建脑卒中后肢体痉挛大鼠模型发现，模型组、DAPT组大鼠Zea Longa评分升高，表明脑卒中大鼠神经功能严重受损，选取手少阳三焦经“天井”穴与足少阳胆经“正营”“环跳”穴位合用，予以通利枢机针刺法干预后，大鼠Zea Longa评分显著降低，提示通利枢机针刺法能促进大鼠神经功能恢复，取少阳经穴可调节阴阳消长，宣利上焦，通利下焦，使枢机正常运转，脑神得正，有效疏导神经，促进兴奋性神经递质释放，进而改善大鼠神经功能。脑卒中后肢体痉挛大鼠肌张力明显升高，运动功能受损，本研究显示，模型组、DAPT组大鼠Feeney平衡木评分提高，电生理描记结果降低，提示脑卒中后肢体痉挛大鼠肢体功能异常，而予以通利枢机针刺法干预后，针刺组大鼠Feeney平衡木评分明显降低，电生理描记结果明显升高，说明通利枢机针刺法在提高大鼠肢体功能方面效果显著，针刺“天井”“正营”“环跳”穴，切入脑脉痹阻病机，可引病邪由重转轻，气机开阖有度，气血阴阳交通无碍，枢机通畅，四肢筋骨得以舒展，脏腑功能得以恢复，共奏枢机通利之功，从而降低大鼠肌张力，提高运动功能，促使大鼠肢体功能得到有效恢复。

国外学者广泛研究Notch信号通路在神经系统发育中的作用，认为Notch通路在神经元、神经胶质细胞中表达，与诸多神经系统疾病有关，了解潜在机制或可为疾病治疗提供新见解[23-24]。Notch通路由Notch受体(Notch1-4)、Notch配体(Jagged1-2、Delta-like1、3、4)、DNA结合蛋白、Notch调节分子等组成，作为一个多维基因调控网络系统，其调节功能多样，现有研究表明，其在神经元凋亡、神经干细胞分化等方面具有重要的调控作用[25-27]。谢莉娜[28]研究发现，电针可促进脑卒中肢体痉挛大鼠海马区突触可塑性相关蛋白、GABAa受体等表达，以缓解肢体痉挛状态。虽已知晓脑卒中后肢体痉挛与神经再生密切相关，但具体作用机制尚缺乏研究支持，本研究为明确Notch通路与脑卒中后肢体痉挛状态的关系，分组干预后发现，模型组、DAPT组大鼠脑组织中Notch1、Jagged1、GABAamRNA与蛋白表达水平降低，GAT-1mRNA与蛋白表达水平升高，提示Notch通路参与脑卒中后肢体痉挛发展过程；使用通利枢机针刺法治疗后，Notch1、Jagged1、GABAamRNA与蛋白表达水平升高，GAT-1mRNA与蛋白表达水平降低，提示通利枢机针刺法可能参与促进Notch通路表达的作用，以通畅气血经络；在应用通利枢机针刺法治疗同时，还使用Notch信号通路抑制剂DAPT，结果发现，针刺组大鼠脑Notch1、Jagged1、GABAa蛋白表达水平高于针刺+DAPT组，GAT-1蛋白表达低于针刺+DAPT组，证实通利枢机针刺法可发挥调节枢机、通畅气血的作用，以促进Notch通路、GABAa受体蛋白表达，降低GAT-1蛋白表达，进而促进神经元突触传递，利于神经元再生，改善大鼠神经与肢体功能。

综上，通利枢机针刺法可改善脑卒中后肢体痉挛大鼠的神经功能、肢体功能，作用机制可能与调控Notch通路相关蛋白表达有关，为临床脑卒中后肢体痉挛治疗提供实验与理论依据。