适配体功能化分子印迹聚合物的研究进展

褚 希,叶 泰,袁 敏,曹 慧,郝丽玲,吴秀秀,阴凤琴,于劲松,徐 斐

(上海理工大学 健康科学与工程学院,上海食品快速检测工程技术研究中心,上海 200093)

分子印迹技术自1931年首次被提出至今,作为合成具有选择性识别能力的聚合物的重要手段之一,已被广泛应用于金属离子、小分子化合物、核酸和蛋白的分离、富集和传感[1-3]。制备得到的分子印迹聚合物(MIP)具有特定的分子识别结合位点、良好的机械强度以及环境稳定性等特性[4]。在MIP的制备过程中,模板分子通常预先与功能单体组装,在引发剂和交联剂的共同作用下形成内嵌模板分子的聚合物网络,除去模板分子后,得到具有识别结合能力的三维印迹空腔[5-8]。合适的功能单体是提高MIP选择性和亲和力的基础,功能单体(如丙烯酰胺[9]、氨基硅烷[10]、甲基丙烯酸[11]等)与模板分子通过共价键或非共价键形成特定的识别位点,然而这种识别机制的应用面临许多局限。近年来,为了提高MIP 对目标分子的结合能力,研究者们以抗体[12]和肽链[13-14]作为功能单体聚合到印迹空腔中。与传统小分子功能单体相比,尽管采用这种大分子功能单体制备得到的MIP 具有更优的亲和力和更好的选择性,但是存在制备成本高、化学稳定性差等问题。

适配体(Apt)是通过指数富集的配基系统进化(SELEX)技术进行体外筛选得到的具有特异性靶标识别能力的寡核苷酸链[15]。近年来,越来越多的研究者以Apt作为大分子功能单体制备适配体功能化分子印迹聚合物(Apt-MIP),其不仅可以通过构筑多个识别位点提高印迹空腔对模板分子的结合能力,同时制备过程中所形成的聚合物印迹层能够有效稳定Apt与模板分子的结合构象,提高Apt的亲和力[16]。在与靶标的识别结合过程中,Apt通过π-π堆积、静电相互作用、范德华力以及氢键等自适应地折叠成具有特定识别能力的空间构象,从而实现对靶标的特异性识别[17-18]。与抗体相比,Apt易于化学合成与修饰,有利于将其与靶标的识别结合定量地转化为光、电等信号输出[19-20],为MIP 识别结合模板分子过程中的信号转换提供了新的思路[21]。本工作介绍了Apt-MIP 的制备方法,并对其在生物传感器以及分离与富集方面的应用进行了综述和展望。

1 Apt-MIP的制备

将Apt嵌入印迹空腔是制备Apt-MIP的关键,目前常见的印迹策略主要有自由基聚合和电聚合两类[22-23]。

1.1 自由基聚合

自由基聚合是通过光、热等引发乙烯基等功能单体聚合,是对聚合物链拓扑结构和功能调控的重要手段之一,被广泛用于MIP 的制备。2013 年,SPIVAK 课题组[24]首次采用末端修饰丙烯基的Apt和丙烯酰胺作为功能单体,通过自由基聚合制备了凝血酶和血小板衍生生长因子的分子印迹凝胶,该凝胶对模板蛋白表现出良好的溶胀响应,其亲和力较无Apt的提高了4.5～5.0倍。在此基础上,SPIVAK 课题组[25]将Apt功能化分子印迹凝胶与光栅衍射传感器耦合,利用激光传输装置将凝胶体积变化转化为光衍射信号用于苹果茎痘病毒检测,检出限低至10μg·L-1,弥补了蛋白等大分子物质在凝胶中扩散速率较慢的缺陷。在分子印迹凝胶的制备过程中,Apt中烯烃基团修饰的位置和数量可能破坏Apt与靶标的结合构象,进而影响分子印迹凝胶的识别性能。POMA 等[26]在可卡因Apt中引入烯烃改性的2′-脱氧尿苷残基,使Apt和聚合物层之间形成单个或多个共价锚定位点,所制备的Apt功能化分子印迹凝胶的亲和力是无Apt的6.6倍。然而,仅在靠近可卡因Apt 3′端处引入单个烯烃修饰的分子印迹凝胶则几乎失去了对可卡因的结合能力。与修饰未剪裁的Apt相比,采用短链Apt片段作为功能单体,其稳定性更好、成本更低。ZHANG等[27]以丙烯基修饰的分裂型三磷酸腺苷Apt片段作为功能单体制备分子印迹凝胶,其亲和力比无Apt的高15倍。并且,与游离的分裂型Apt片段相比,印迹后其亲和力增加了一倍。为了获得性能优异的分子印迹凝胶,除了改变Apt的修饰策略外,合适的共聚单体有利于提高其选择性识别的能力。LI等[28]针对腺苷Apt识别过程易受脱氧腺苷干扰的问题,在聚合过程中引入丙烯酰胺基苯硼酸作为共聚单体,制备了Apt功能化分子印迹凝胶,利用硼酸基团与腺苷分子中顺式二醇间的共价作用,实现了对腺苷的高选择性识别。将多个Apt聚集在印迹位点形成多价效应[29],能够有效提高Apt与分子印迹凝胶的协同识别。

1.2 电聚合

电聚合是在一定电势或电流的作用下在电极表面引发聚合的过程,其中导电聚合物层在模板分子存在的情况下涂覆在电极或支撑基板材料上。与自由基聚合相比,电聚合具有制备快速、印迹层厚度和形貌可控以及制备的聚合物在传感器表面黏附性好等特点,因此被广泛应用于分子印迹修饰电极生物传感器的制备[30]。JOLLY 等[31]将末端巯基修饰的前列腺特异抗原Apt固定到金电极表面,通过控制聚多巴胺沉积到前列腺特异抗原Apt复合物的周围,洗脱蛋白模板后得到Apt功能化的聚多巴胺印迹层。与Apt修饰电极相比,制备的Apt-MIP修饰电极对前列腺特异抗原的灵敏度更高,检出限低至1 ng·L-1。然而,对比聚多巴胺沉积前后Apt的选择性发现,印迹后Apt的选择性系数较游离Apt低了5倍[32-33]。这种电聚合印迹层造成的Apt选择性降低,可能是由于电活性单体聚合过程中产生了大量非特异性结合位点。另一方面,电聚合单体不仅用于构筑聚合物层,同时还决定了印迹空腔中除Apt 外的结合位点的性质。ROUSHANI等[34]利用间苯二酚中的-OH 与氯霉素分子中的-NO2、-OH、-NH 等基团形成氢键,进一步增强了印迹空腔的识别能力。ROUSHANI等[35]选择邻苯二胺和邻二羟基苯作为双功能单体,使得聚合物层中分布-NH 和-OH 等多种结合位点,提高了对靶标的结合效率,所构筑的Apt-MIP修饰电极对毒死蜱的结合响应平衡时间仅为9 min。此外,MOKHTARI等[36]选择电活性物质亚甲基蓝作为聚合单体,制备了兼具优异导电性和稳定性的肌钙蛋白Apt-MIP,其修饰电极对模板分子的检出限低至1.04 pmol·L-1。

2 生物传感器

2.1 电化学传感器

电化学分析方法因具有灵敏度高、响应快速以及操作简便等优势而被广泛关注,在电极表面修饰MIP[37-39]或Apt[40-42]来制备电化学传感器,能够实现对靶标的选择性识别。然而,样品中非电活性物质吸附到电极表面所导致的电极污染问题,严重阻碍了分析物与电极表面的接触,降低了电化学传感器的检测灵敏度[43]。在电极表面修饰Apt-MIP 能够减少非特异性吸附,同时可提高电极界面Apt对靶标的亲和力。RAD 等[44]将巯基修饰的四环素(TET)Apt固定在纳米金沉积的电极表面,通过电聚合将多巴胺包覆在Apt周围,制备的修饰电极对TET 检出限低至144 fmol·L-1。基于相似的策略,SHAHDOST-FARD 等[45]将Apt固定在纳米金-富勒烯复合物修饰的玻碳电极表面,以多巴胺为电聚合单体,制备了用于超灵敏度检测土壤和水样中2,4,6-三硝基甲苯(TNT)的电化学传感器,其线性范围为1.0×10-8～1.5μmol·L-1,检出限为3.5×10-12μmol·L-1。双链DNA(dsDNA)除了通过多种活性基团与靶标结合外,还可以通过特有的沟槽结构识别不同构象的分子。张连明等[46-47]选择特定的dsDNA 构建了用于西马特罗分子特异性检测的电化学传感器,检出限为3.2×10-14mol·L-1。在此之后还制备了对右旋肉碱选择性识别的电化学传感器。引入dsDNA 后,该电化学传感器对左旋肉碱几乎没有响应。基于三聚氰胺可以与胸腺嘧啶通过氢键形成稳定结构,YU 等[48]将聚胸腺嘧啶作为识别元件嵌入由电聚合得到的聚多巴胺印迹空腔中,构筑了Apt-MIP 修饰的电化学传感器,采用差分脉冲伏安法实现了对三聚氰胺的超灵敏度检测,吸附20 min时的检出限为0.67 pmol·L-1。

在Apt-MIP制备过程中,界面上固定Apt的载量决定了印迹过程中形成特异性识别空腔的数量。为了提高Apt-MIP 修饰电极的导电性和印迹层中Apt的载量,MAHMOUD 等[49]在金纳米颗粒羧化碳纳米管修饰的玻碳电极上固定组胺Apt,以邻苯二胺为功能单体,通过电聚合制备Apt-MIP修饰电极,采用差分脉冲伏安法测定组胺的含量,检出限低至0.15 nmol·L-1,分别是相应的Apt和MIP 修饰电极的1/3 和1/5。YARAHMADI 等[50]和GHANBARI等[51]分别以纳米金和壳聚糖修饰的多壁碳纳米管(MWCNTs)作为Apt固定载体制备修饰电极,利用MWCNTs良好的导电性以及较大的比表面积,增加了电极表面聚多巴胺印迹层中Apt的固定量,所构筑的电化学传感器对尿素和丙型肝炎病毒核心抗原的检出限分别为900 fmol·L-1和1.67 fg·m L-1,并且表现出良好的稳定性和重现性。电致化学发光(ECL)是将电化学反应通过能量传递转换为光信号输出的分析方法,具有灵敏度高、线性范围宽等优点。LI等[52]在氧化石墨烯-纳米金复合物(GO-Au)修饰的电极表面,以邻氨基苯酚为功能单体,通过电聚合的方式将碳点标记的林可霉素Apt共聚到印迹空腔内,构筑了ECL 检测平台。当林可霉素与Apt-MIP 结合时,GO-Au与碳点间的ECL 共振能量转移被抑制,导致ECL信号显著降低,从而实现对林可霉素的超灵敏度检测,检出限低至0.16 pmol·L-1。

除了通过电聚合在电极表面构筑印迹层外,还可将Apt嵌入导电印迹凝胶中,利用印迹凝胶识别结合靶标过程中凝胶的收缩行为对其导电能力的影响,实现对模板分子的检测。WU 课题组[53-54]以丙烯基修饰的凝血酶Apt和C 反应蛋白Apt作为大分子功能单体,通过自由基引发共聚到丙烯酰胺水凝胶中,分别构筑了纳米金和聚吡咯纳米线修饰的导电印迹水凝胶。当Apt功能化的印迹空腔与靶标识别结合时,凝胶聚合物网络发生收缩,利用聚合物网络收缩和凝胶电导特性变化耦合所构筑的“信号级联放大”策略,通过监测电导的变化来实现对凝血酶和C反应蛋白的定量检测,检出限分别为1.0×10-18mol·L-1和1.0×10-19mol·L-1。

2.2 荧光传感器

将荧光纳米材料作为信号报告基团包覆到MIP内,制备得到的荧光MIP兼备荧光传感的高灵敏度以及MIP 对模板分子的高选择性[55-56]。将Apt修饰到荧光纳米材料表面,不仅为模板分子识别提供了新的结合位点,同时也有利于实现高灵敏度检测。LIANG 课题组[57-58]利用“溶胶-凝胶共价偶联”策略,分别在锰掺杂的ZnS量子点和CdSe量子点表面修饰乙烯基,以甲基丙烯酸为功能单体,亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,通过自由基引发的聚合反应在量子点表面形成印迹空腔,制备了用于细胞色素C(Cyt C)和卡那霉素检测的Apt功能化分子印迹荧光传感器。其中,末端修饰巯基的Apt通过硫醇-烯点击化学反应固定于印迹空腔中。基于Apt和印迹空腔的双识别效应,所制备的荧光传感器对Cyt C 和卡那霉素的选择性因子分别为3.17和3.51,检出限分别为54 nmol·L-1和13μg·L-1。

与量子点等典型的下转换荧光纳米材料相比,激发光谱位于近红外光区的上转换荧光纳米材料在克服样品因紫外吸收导致的自体背景荧光干扰和检测灵敏度方面表现出更优的性能[59]。LIU 等[60]以氨基修饰的硅烷化上转换荧光纳米材料作为荧光信号报告基团,将恩诺沙星Apt共价偶联到其表面,通过自由基聚合形成印迹层,所制备的“双识别”荧光传感器对恩诺沙星的检出限低至0.04μg·L-1。

除了小分子化合物和大分子蛋白外,近年来针对镉、铅等重金属离子,通过SELEX 技术也筛选得到了一系列具有较好亲和力和较优专一识别性能的Apt[61-62]。LI等[63]制备了硫、氮共掺杂荧光碳点-纳米金复合材料(SN-CQD/Au),将巯基修饰的Cd2＋Apt通过金-硫键固定到SN-CQD/Au 表面,通过紫外光引发L-丙氨酸聚合形成印迹层。由于Cd2＋能够有效猝灭碳点的荧光,制备得到的荧光传感器在8 min的响应平衡时间内对Cd2＋的检出限低至1.2 pmol·L-1。

2.3 其他传感器

除了电化学传感器和荧光传感器外,将Apt-MIP与其他传感技术结合也表现出令人欣喜的研究前景。LI等[64]通过金-硫键将糖蛋白碱性磷酸酶(ALP)Apt固定在镀金基片上,通过改变聚合时间来调控聚多巴胺印迹层的厚度,制备了Apt-MIP;同时,在氨基苯硫酚修饰的银纳米颗粒上进一步修饰甲酰苯硼酸,利用其表面的硼酸基团与糖蛋白的硼亲和作用,与Apt-MIP形成免疫夹心识别。结果表明,Apt-MIP 对ALP 的亲和力是单独Apt的50倍,选择性系数是相应游离Apt的3倍,对ALP的测定下限低至62 pmol·L-1。TURNER 课题组[65-66]将Apt-MIP 与表面等离子体共振(SPR)技术相结合,实现了对胰蛋白酶和莫西沙星的非标记检测。在Apt中引入多个羧甲基乙烯基或丙烯酰胺修饰的胸腺嘧啶碱基,采用“多点锚定策略”将Apt嵌入印迹空腔中,以获得Apt与靶标的最佳结合构象。结果显示,采用羧甲基乙烯基改性碱基修饰的胰蛋白酶Apt制备得到的Apt-MIP对靶标的亲和力优于相应单独MIP 和Apt的。针对小分子莫西沙星制备的Apt-MIP 对靶标的亲和力分别是传统MIP和游离Apt的10倍和100倍,SPR 光谱对靶标的检出限低至0.51 nmol·L-1[66]。与其他传感方法相比,基于比色传感的可视化检测因无需依赖复杂的仪器,并且操作简单而受到研究者们的青睐。SHEN 等[67]等将Apt固定到具有过氧化物模拟酶活性的Fe3O4纳米颗粒表面,制备了凝血酶Apt-MIP。通过凝血酶与印迹空腔的结合,从而抑制Fe3O4纳米颗粒催化底物显色的能力,进而实现对凝血酶的超灵敏度检测,检出限为27.8 pmol·L-1。

3 分离与富集

MIP因具有较大的吸附容量和良好的选择性吸附能力,可作为固相萃取吸附剂用于目标化合物的高效富集[68-69]。然而传统的MIP存在亲和力差、非特异性吸附等问题,采用Apt-MIP有望提高对靶标的选择性富集能力。LYU 等[70]针对啤酒中可能存在的赭曲霉毒素A(OTA),制备了Apt-MIP 整体柱用于液相色谱检测。通过对比Apt-MIP 整体柱、Apt整体柱和MIP 整体柱对OTA 和赭曲霉毒素B(OTB)的回收率,发现Apt-MIP 整体柱对OTA 与OTB回收率比值为116.1,而单独采用Apt整体柱和MIP整体柱时,该比值仅为40.8和69.0。即便在OTB 的浓度水平是OTA 10倍的情况下,Apt-MIP整体柱对OTB 的回收率仅为2.9%,表明Apt-MIP整体柱在复杂样品基质中依然具有较好的选择性吸附能力。

与吸附小分子化合物相比,传质速率低、吸附容量差和选择性差依然是MIP 用于蛋白等大分子化合物富集的瓶颈。为了提高MIP 对模板蛋白的吸附容量,减少非特异性吸附,WANG 等[71]通过静电吸附作用,将大量纳米金颗粒吸附到氨基修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒表面,通过金-硫键将Apt固定在纳米金颗粒上,采用“溶胶-凝胶”策略制备了蛋白标志物胰岛素和甲胎蛋白的分级结构Apt-MIP。将制备的Apt-MIP 与基质辅助激光解析时间飞行质谱联用,实现了人血清样本中低至0.5μg·L-1胰岛素的超灵敏度检测,并且在检测过程中可以显著区分健康人与病人血清中胰岛素与甲胎蛋白的差异。SHOGHI等[72]以短链聚乙二醇和3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为二维共聚单体,制备了牛血清白蛋白(BSA)Apt-MIP,其对BSA 的选择性吸附系数为65,吸附容量高达146 mg·g-1,远高于对溶菌酶等其他干扰蛋白的。与非印迹聚合物相比,Apt-MIP在吸附容量上具有显著优势。

对于整体细胞印迹而言,缓慢的吸附进程与低效的富集水平一直是难以克服的挑战。LIU 等[73]采用印迹位点后修饰的方式,通过硫醇-烯点击化学反应将Apt固定在印迹位点处,实现了对循环肿瘤细胞SMMC-7721的高效捕获和释放,其富集因子高达21.6,远优于单独MIP或Apt的捕获效果。

4 结论与展望

将MIP 与Apt相结合,制备得到的Apt-MIP在分析传感和固相萃取方面具有显著优势,主要表现为:①通过Apt对靶标的特异性结合,增强了MIP的选择性识别能力;②印迹过程所形成的聚合物层能够固定Apt与靶标结合的最佳构象,提高Apt在复杂环境中结合靶标的能力。

目前,基于Apt-MIP的生物传感器大都集中于电化学传感器,有限的电聚合单体在一定程度上限制了印迹空腔内的识别位点。在今后的研究中,进一步利用核酸分子易于修饰的特性,通过与具有光、电、磁特性的纳米材料相结合,将为Apt-MIP 与靶标的识别结合提供新的信号转换机制;深入理解Apt和印迹聚合物层对靶标识别结合的协同作用机制,将有利于指导Apt-MIP 的设计与制备,获得兼具高亲和力和高选择性的识别空腔;此外,与大多数分子模板相比,金属离子往往具有相同的电荷和相似的离子半径,如何利用Apt-MIP实现对金属离子的选择性识别也是未来重要的研究方向。