人工饲料和桑叶对家蚕机体3 种代谢酶活性的影响

王永生，朱水芬，陈 松，陈云明，江 亚，范永慧，杨启慧，李琼艳，杨 海

（1.云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101；2.云南省蚕桑育种及高效生产工程研究中心，云南 蒙自 661101）

羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarE）、乙酰胆碱酯 酶（Acetylcholinesterase，AchE）和 碱 性 磷 酸 酶（Alkaline phosphatase，ALP）是生物体重要的代谢酶类[1-2]。CarE 是一类广泛存在于动物、植物、微生物和昆虫体内的代谢解毒酶，不仅能将内源性或外源性含有酯键的化合物分解为对应的醇和酸，而且在机体脂类物质转运和发育调控等方面也发挥了一定的功能[3-4]。AchE 是生物体一种极其重要的神经递质水解酶，其主要功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach），从而终止Ach 对乙酰胆碱受体的刺激作用，保证神经冲动在突触间的正常传导，维持生物体的正常生理功能。同时，AchE还是有机磷类和氨基甲酸酯类农药的重要作用靶标[5-6]。CarE 和AchE 作为昆虫机体重要的两类酯酶，主要介导昆虫机体的抗逆性过程[7-8]。家蚕CarE 和AchE 在机体代谢有机磷和氨基甲酸酯类农药以及抵御病原微生物侵染过程中发挥了一定的功能，它们的活性大小在一定程度上反映了蚕体的代谢及生理状态[8-9]。ALP 是一类高度保守的磷酸水解酶，直接参与了生物体磷酸基团的转移和代谢过程[10-11]。ALP 不仅参与昆虫的生长发育、神经传导、物质代谢和滞育等过程，而且还参与了昆虫机体的解毒代谢和免疫防御过程[12-13]。已有研究表明，ALP 参与家蚕机体营养物质的代谢吸收，该酶活性的增强有助于提高蚕体的抗逆性及茧丝产量和质量[14]。

家蚕（Bombyx mori）作为一种重要的特种经济昆虫，主要以桑叶为单一食物来源。人工饲料是根据家蚕的食性特点和营养要求配制成的用以代替桑叶的饲料，因其可以突破季节限制、便于实行机械化，越来越受到人们的关注[15]。人工饲料养蚕是今后养蚕业发展的重要方向，但是与桑叶饲育相比，全龄用人工饲料饲育的蚕存在体质弱、发育不齐、产丝量少等问题[16]。改良人工饲料的配方，探索适宜的人工饲料添加剂，使其有利于激活蚕体代谢酶和解毒酶活性，增强自身体质和提高抗逆性，成为亟待解决的问题。CarE、AchE 和ALP 对昆虫机体生物代谢的稳定性极其重要，其活性大小与机体的生理状态及抗逆性和抗病性密切相关。目前，关于人工饲料对家蚕体内ALP、AchE 和CarE 活性影响的研究尚未见报道。

鉴于此，通过比较家蚕取食人工饲料和桑叶后机体不同组织ALP、AchE 和CarE 的活性差异，探究人工饲料和桑叶饲育对蚕体3 种代谢酶活性的影响，明确饲料因素的变化对家蚕抗性生理的影响，以期为优化和改良人工饲料配方及饲育技术提供参考。

1 材料和方法

1.1 家蚕来源

P50家蚕品种由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 恒温恒湿光照培养箱、雪科牌IMS-40 雪花制冰机和HSW24 型电热恒温水浴锅购自广州深华生物技术有限公司；ThermoFisher 双光束紫外/可见分光光度计和高速冷冻离心机购自昆明伯腾仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂 家蚕人工饲料购自重庆正佳饲料有限公司；无水乙醇和冰醋酸购自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012S）购自碧云天生物技术有限公司。碱性磷酸酶ALP 活性检测试剂盒（货号：BC2140）、羧酸酯酶CarE 活性检测试剂盒（货号：BC0840）和乙酰胆碱酯酶AchE 活性检测试剂盒（货号：BC2020）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 处理分组和样品采集 用新鲜桑叶饲养家蚕至五龄起，随机分成2 组，一组继续用桑叶饲养，另一组改用人工饲料饲养。从开始进食计时，随后每隔12 h，冰上解剖家蚕幼虫，取血淋巴、中肠组织。总共取材6 次（取材时间点12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h）。2 个处理组每次取样均设3 次重复，每个重复取4 头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存。

1.3.2 酶液制备和活性测定 中肠组织酶液制备：取0.5 g 的中肠组织放入预冷的研钵中，分别加入1.5 mL 各个酶活性测定试剂盒提供的抽提液，迅速充分研磨匀浆，随后将匀浆液转移至新的2 mL离心管中，4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min，吸取上清液作为待测酶液。血淋巴酶液制备：取350 μL血淋巴，分别加入1.0 mL 酶活性测定试剂盒提供的抽提液，随后在4 ℃条件下10 000 r/min 离心10 min，弃沉淀取上清液，即为待测酶液。按照BCA 蛋白质测定试剂盒和3种酶（碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶）试剂盒操作分别测定蛋白质浓度和酶活性。

1.4 数据分析

利用Excel 2016 和SPSS 21.0 对试验数据进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 人工饲料和桑叶饲育的家蚕不同组织ALP活性变化

图1为喂食人工饲料和桑叶后家蚕血淋巴和中肠组织中ALP 活性变化情况。由图1A 可知，在测定的时间内，喂食人工饲料组家蚕血淋巴中ALP 活性变化不明显，而桑叶组ALP 活性在后期明显增强。在12～48 h，喂食人工饲料组和桑叶组血淋巴ALP 活性无显著差异，而在60、72 h，桑叶组的ALP活性显著高于人工饲料组（P＜0.05），酶活性分别为人工饲料组的1.42、1.81倍。

图1B 结果显示，桑叶组家蚕中肠ALP 活性在36 h 开始显著高于人工饲料组，在48、60、72 h 酶活性持续增强，且极显著高于人工饲料组（P＜0.01），酶活大小分别是人工饲料组的2.88、1.86、2.13倍。

图1 人工饲料和桑叶对家蚕血淋巴（A）和中肠（B）ALP活性的影响Fig.1 Effects of artificial diet and mulberry leaves on ALP enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.2 人工饲料和桑叶饲育的家蚕不同组织CarE活性变化

图2A 结果显示，家蚕血淋巴中CarE 活性整体呈现逐渐增强的趋势，其中人工饲料组酶活性略高于桑叶组，但差异不显著。由图2B可知，在12 h，人工饲料组和桑叶组中肠CarE活性无差异；而在24 h和36 h，人工饲料组CarE 活性开始增强，并显著高于桑叶组（P＜0.05）；随着喂食时间的延长，人工饲料组中肠CarE 活性持续增加，在48 h 和60 h，CarE活性极显著高于桑叶组（P＜0.01），其中在60 h，酶活性升至最高值，约为桑叶组的2.61 倍；而在72 h，CarE 活性虽有一定程度的降低，但仍显著高于桑叶组（P＜0.05）。

图2 人工饲料和桑叶对家蚕血淋巴（A）和中肠（B）CarE活性的影响Fig.2 Effects of artificial diet and mulberry leaves on CarE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

2.3 人工饲料和桑叶饲育的家蚕不同组织AchE活性变化

如图3A 所示，在12 h 和24 h，喂食桑叶组血淋巴AchE 活性略低于人工饲料组，但差异不显著。在36 h，桑叶组血淋巴AchE 活性开始增加并且在48 h、60 h和72 h持续高于人工饲料组，分别是人工饲料组的1.52 倍、1.64 倍和1.71 倍，差异达到显著水平（P＜0.05）。图3B结果表明，在测定的时间范围内，喂食桑叶组家蚕中肠AchE 活性均比人工饲料组高。其中在12～48 h，桑叶组AchE 活性显著高于人工饲料组（P＜0.05）；随着喂食时间的推移，桑叶组AchE 活性继续增强，在60 h 和72 h 持续高于人工饲料组，且差异达到极显著水平（P＜0.01），AchE活性分别为人工饲料组的2.68倍和2.84倍。

图3 人工饲料和桑叶对家蚕血淋巴（A）和中肠（B）AchE活性的影响Fig.3 Effects of artificial diet and mulberry leaves on AchE enzyme activity in hemolymph（A）and midgut（B）ofBombyx mori

3 结论与讨论

ALP、CarE 和AchE 被认为是昆虫机体重要的三大代谢酶，其活性大小受到不同植物饲料、病原微生物及生长环境的影响。薛英伟等[17]比较了桑叶和柘叶对家蚕ALP、AchE、CarE 活性的影响，发现柘叶饲养组蚕体内的ALP 和AchE 活性比桑叶饲养组显著降低，而CarE的活性显著高于桑叶组。家蚕感染核型多角体病毒（BmNPV）后，蚕体内的CarE 活性会大幅度上升，ALP 与AchE 活性显著下降。另外，接种家蚕浓核病毒（BmDNV）后12 h，家蚕抗性品系中肠羧酸酯酶基因BmCarE及其酶活性显著升高，提示羧酸酯酶在抵御BmNPV 和BmDNV 过程发挥一定的功能[18]。喂食槲皮素，能有效诱导CarE 的活性，并且酶活性随喂食槲皮素浓度的增加呈现先升后降的趋势，暗示CarE具有对外源物质解毒代谢的功能[19]。韩琨[20]的研究结果表明，人工饲料育家蚕中肠的α-淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶等活性均低于桑叶育家蚕。

本研究测定了人工饲料和桑叶饲育对五龄家蚕中肠和血淋巴ALP、CarE 和AchE 活性的影响，结果显示，桑叶组的ALP 和AchE 活性在家蚕血淋巴和中肠中均显著高于人工饲料组。另外，桑叶组家蚕血淋巴CarE活性与人工饲料组无明显差异，而中肠CarE 活性显著低于人工饲料组。一般认为，ALP和AchE 活性大小反映了昆虫正常生理代谢活动的强弱。ALP 是昆虫体内调控磷酸代谢的关键酶，参与了机体的能量代谢和生长发育过程[13-14]。AchE作为神经递质乙酰胆碱的水解酶，其活性大小是机体细胞代谢状态的一个重要指标[21-22]。抑制昆虫AchE基因的表达，降低AchE 活性，幼虫会出现生长发育迟缓，雌性成虫的造卵量和产卵率也显著降低[22-23]。CarE 被认为是昆虫机体负责解毒的重要水解酶，其活性受到外源化合物、次生代谢产物及其他 病 原 微 生 物 的 影 响[2-3]。ZHOU 等[24]和CAPPELLOZZA 等[25]研究发现，人工饲料饲育的家蚕，机体能量代谢进程减缓，幼虫抗病性弱，丝蛋白合成减少，分析认为是家蚕进食人工饲料后，参与物质能量代谢的一系列相关酶活性受到不同程度的抑制，影响了正常的生理代谢活动。喂食人工饲料的家蚕中肠CarE酶活性显著高于桑叶饲喂组，推测可能是人工饲料中的某些成分或是代谢产物对中肠组织有一定的损伤或毒害作用，进而导致CarE活性的升高。综上，采用人工饲料饲养的家蚕，其血淋巴和中肠三大代谢酶活性受到一定的影响，导致蚕体正常的生理代谢进程受阻，抵御不良环境的能力减弱。