丁酸梭菌对肉鸡生长、肠道形态及屏障功能的影响

李文嘉，徐 彬，魏凤仙，邓 文，马慧慧，王琳燚，白 杰，孙全友，席燕燕，李绍钰

（河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002）

2021 年我国肉鸡出栏量超90 亿只，高需求不断催生养殖业转向集约化、快速化[1]。但随之而来的问题也层出不穷，最为突显的是畜禽对高密度饲养环境的应激强烈[2]，严重影响家禽生产性能和产品品质。诸多研究指出，集约化、高密度饲养降低肉鸡生长性能、饲料效率和胴体性状，诱导机体产生氧化应激和免疫反应，并对肉鸡肠道功能造成损伤[3-5]。然而，为了提高经济效益、维持养殖动物健康，企业会选择在饲料中添加低于治疗剂量的抗生素以提高生产率[6-7]。这直接导致抗生素的滥用和畜产品安全问题，因此，我国自2020 年7 月1 日起，严禁饲料企业向商品饲料中添加促生长类药物（中药类除外）[8]。然而随着我国禁抗的全面实施，以及人民对食品安全问题的日益重视，在维持动物生产性能的同时需要提高其产品品质，亟需寻找一种或多种可增强家禽自然防御能力的抗生素替代品。

目前，可供选择且安全的抗生素替代品包括植物提取物、益生菌、中成药制剂等[9]。其中，益生菌被认为是一种具有生物活性且对宿主有正面效益的微生物，相对于其他抗生素替代品还具有易制备、成分单一、纯度高、成本低等特点。近10 a 来，益生菌受到广泛的研究，在家禽养殖业中通常使用的益生菌有乳酸菌类、丁酸梭菌类、芽孢杆菌类等。研究指出，益生菌不仅可以促进养殖动物生长、饲料利用以及改善肉蛋品质，更重要的是对肠道屏障功 能 有 促 进 作 用[10-12]。丁 酸 梭 菌（Clostridiumbutyricum）是一种革兰氏阳性厌氧菌，通常存在于人和动物的肠道以及粪便中[13]。作为一种常见的益生菌，丁酸梭菌对动物胃液、肠液中的消化酶以及胆汁都具有较强耐受性，易于在动物肠道中定殖，并建立酸性环境，从而起到抑制肠道中的致病菌的作用；同时，丁酸梭菌还可以产生丁酸——短链脂肪酸（SCFA）中的一种，是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，具有促进肉鸡肠道发育、增强营养物质消化吸收的作用[14-15]。有研究指出，饲料中添加丁酸梭菌可改善养殖动物生长性能，提高免疫功能和抗氧化能力，维持或恢复肠道菌群结构[16]。为此，以肉鸡为研究对象，以有效调节肉鸡肠道健康、促进肉鸡生长为切入点，研究日粮中添加丁酸梭菌对肉鸡肠道形态、肠道屏障功能以及生长性能的影响，为丁酸梭菌在肉鸡生产中作为一种抗生素替代品被更加广泛的使用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

丁酸梭菌制剂活菌数为3×109cfu/g（浙江惠嘉生物技术有限公司）；抗生素为含50%的维吉尼亚霉素。

1.2 试验设计

选取健康且体态接近的1 日龄爱拔益加（AA）肉仔鸡[平均体质量为（44.39±0.14）g]324 只，随机分成3 个处理，每处理6 个重复，每个重复18 只仔公鸡。试验基础日粮主要参照《鸡饲养标准》设计，配制成以玉米、豆油为主要能量源，豆粕为主要蛋白质源的粉状饲料（表1）。对照组（CON）饲喂基础日粮，抗生素组（ANT）和丁酸梭菌组（CB）分别饲喂基础日粮中含10 mg/kg 维吉尼亚霉素和1×109cfu/kg丁酸梭菌的日粮。

表1 基础日粮组成及营养水平（风干基础）Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）

1.3 饲养管理

试验于2020 年在河南省农业科学院畜牧兽医研究所尉氏养殖基地（开封市尉氏县）进行。采用双层笼养（1 m×1 m）方式进行饲养，鸡舍内光照黑暗时间比为23∶1，试验期间鸡只自由采食饮水，并同时按正常免疫程序进行接种。舍内初始温度由1日龄时的34 ℃逐步降低稳定至21日龄时的24 ℃。试验期为42 d，分为前期（1—21 日龄）和后期（22—42日龄）2个阶段。

1.4 样品采集及指标测定

1.4.1 生长性能指标测定 试验开始第1 日，记录肉鸡体质量。于42日龄，称量并记录各组肉鸡余料量、耗料量、死亡数以及测定肉鸡末体质量。根据统计数据计算平均日增质量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.4.2 血清指标测定 分别于21、42 日龄，各组重复中随机选取肉鸡2 只，由翅静脉处采血5 mL，于常温下放置20 min 后离心15 min（3 000 r/min），-80 ℃分装保存。采用酶联免疫（ELISA）竞争法测定血清中细胞因子及焦亡相关蛋白水平，包括白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-18（IL-18）、白细胞介素-1β（IL-1β）和半胱天冬酶-1（Caspase-1），具体操作参照相关试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行。

1.4.3 肠道黏膜采集和相关指标测定 取完血清后用30 mg/mL 的戊巴比妥钠稀释液将肉鸡麻醉致死。鸡处死后迅速剖开腹腔，截取空肠肠段并用预冷磷酸盐缓冲液冲洗食糜，刮取肠黏膜至冻存管中，-80 ℃保存，用于分泌型免疫球蛋白A（sIgA）含量测定（按照南京建成生物工程研究所试剂盒操作说明进行）和肠黏膜总RNA提取。

肉鸡空肠黏膜总RNA 使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提 取。采 用TaKaRa 试剂盒PrimeScriptTMRT Master Mix 将提取的总RNA反转录为cDNA。设置内参基因为三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH），按照TaKaRa 试剂盒TB Green®Premix ExTaq™Ⅱ说明书配制相应反应体系，使用荧光定量反应仪器（Light Cycler 96，罗氏）进行荧光定量PCR，检测目的基因IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18、Claudin-1、Occludin-1、ZO-1和Caspase-1，其引物序列见表2。采用相对定量法（2-ΔΔCT）进行数据分析[17]。

表2 内参基因和目的基因引物序列Tab.2 Primer sequences of targeted and reference genes

1.4.4 肠道组织形态测定 取未采集过肠黏膜的十二指肠、空肠和回肠肠段置于冰上，用准备好的缓冲液稍作冲洗，以去除肠道内容物，分别收集长度为3 cm 的完整中段，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。后经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块等处理，制作石蜡切片（Leica RM 2016，德国），用苏木精-伊红染色，在光学显微镜（Olympus BX53，奥林巴斯光学公司，深圳，中国）下观察空肠、回肠和十二指肠形态学指标，统计并测算隐窝深度（Crypt depth）、绒毛高度（Villus height）以及绒毛高/隐窝深（V/C）比值。

1.5 数据分析

结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0 软件中的one-way ANOVA 分析（单因素方差分析）。用Duncan氏法进行组间差异性多重比较。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响

由表3 可知，在试验全期，与对照组相比，抗生素组和丁酸梭菌组的平均日增质量以及末质量分别升高6.31%、8.43%和6.26%、8.31%。丁酸梭菌组料重比与对照组相比显著下降3.28%。各组之间平均日采食量无明显变化。

表3 丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响Tab.3 Effects ofC.butyricumon growth performance of broilers

2.2 丁酸梭菌对肉鸡血清细胞因子和焦亡相关蛋白水平的影响

由表4 可知，在焦亡蛋白方面，血清Caspase-1水平在21 日龄没有受到影响（P＞0.05）；在42 日龄，与对照组相比，丁酸梭菌组Caspase-1和IL-18水平显著下降24.91%和42.96%（P＜0.05）。在细胞因子方面，与对照组相比，丁酸梭菌组IL-1β 在21、42 日龄分别显著降低19.34%、19.91%（P＜0.05）；血清IL-10水平无显著变化（P＞0.05）。

表4 丁酸梭菌对肉鸡血清细胞因子和焦亡相关蛋白水平的影响Tab.4 Effects ofC.butyricumon serum cytokines and pyroptosis-related proteins of broilers ng/L

2.3 丁酸梭菌对肉鸡肠黏膜sIgA的影响

由表5 可知，空肠sIgA 水平在21 日龄没有明显变化（P＞0.05）；在42 日龄，丁酸梭菌组与对照组相比肉鸡空肠sIgA显著升高26.50%（P＜0.05）。

表5 丁酸梭菌对21日龄和42日龄肉鸡空肠sIgA的影响Tab.5 Effects ofC.butyricumon sIgA in jejunum of broilers at 21 and 42 days ng/mg

2.4 丁酸梭菌对肉鸡肠道形态的影响

由表6可知，空肠中与对照组相比，丁酸梭菌组和抗生素组绒毛高度与V/C 比值分别显著提高13.40%、54.20%和37.34%、55.39%；各组间隐窝深度无显著差异。十二指肠中，与对照组相比，抗生素组绒毛高度与V/C 比值分别提高21.93% 和56.57%（P＜0.05），隐窝深度显著下降21.66%（P＜0.05）。回肠中，与对照组相比，抗生素组绒毛高度显著升高37.40%（P＜0.05），丁酸梭菌组隐窝深度显著下降32.62%（P＜0.05），丁酸梭菌组和抗生素组V/C 比值显著高于对照组60.76% 和56.93%（P＜0.05）。

表6 丁酸梭菌对42日龄肉鸡肠道形态的影响Tab.6 Effects ofC.butyricumon intestinal morphology of broilers at 42 days

2.5 丁酸梭菌对肉鸡肠道黏膜细胞焦亡和肠道屏障相关基因mRNA表达丰度的影响

由图1 可知，在42 日龄丁酸梭菌和抗生素组肠黏膜IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-18mRNA 相对表达丰度显著低于对照组（P＜0.05）。在21、42 日龄，对照组肠黏膜Caspase-1mRNA 相对表达丰度均显著高于丁酸梭菌和抗生素组（P＜0.05）。在21 日龄，与对照组相比，丁酸梭菌组、抗生素组闭合小环蛋白-1 基因（ZO-1）mRNA 表达水平均显著上调。在21 日龄，各组间闭合蛋白-1 基因（Claudin-1）mRNA 水平差异不显著（P＞0.05）；在42 日龄，丁酸梭菌组Claudin-1mRNA 相对表达水平显著上调（P＜0.05）。各组间IL-10和Occludin-1mRNA表达量均无显著差异（P＞0.05）。

图1 丁酸梭菌对肉鸡空肠黏膜细胞焦亡和肠道屏障相关基因mRNA表达丰度的影响Fig.1 Effects ofC.butyricumon mRNA relative expression level of pyroptosis and intestinal barrier related genes in jejunum mucosa of broilers

3 结论与讨论

3.1 丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响

高密度饲养会导致肉鸡产生较大的环境应激，病害频发，经济效益下降[18]。益生菌是一种具有生物活性的可以改善家禽生长及免疫性能等对宿主有正面效益的微生物[12]。本研究结果显示，与饲喂基础日粮组相比，丁酸梭菌添加组肉鸡平均日增质量和末质量显著升高，料重比显著降低，与贾聪慧等[2]、赵强等[19]、LIAO 等[20]和ZHANG 等[16，21]的研究结果一致。这表明饲料中添加一定量的丁酸梭菌可以促进肉鸡的生长，并可作为一种抗生素的替代品。这可能是由于丁酸梭菌在家禽体内可产生消化酶、SCFA 及维生素等益生物，并以此促进家禽对营养物质的利用[22]；另外，丁酸梭菌还能通过竞争营养物质和黏附位点从而抑制有害菌的生长，改善肠道菌群环境[23]。然而，有关丁酸梭菌在家禽饲料中添加量以及应用效果的报道不尽相同[24]。其原因可能是各个试验所用的菌种、剂型和发酵水平有所不同，养殖品种、阶段及管理水平也有差异所致[25]。

3.2 丁酸梭菌对肉鸡肠道形态的影响

肠道是动物消化、吸收营养的重要场所，肠道形态的完整性，尤其是绒毛高度、隐窝深度及V/C值是衡量肠道功能的关键指标。肠道功能与隐窝深度呈负相关性，与绒毛高度呈正相关[22]。前人研究表明，日粮中添加丁酸梭菌能显著改善养殖动物肠绒毛萎缩和隐窝增生现象[26-27]，使空肠和回肠绒毛长度显著增加[28]，提高肠绒毛高和V/C 比值[29]。本研究结果显示，丁酸梭菌显著增加了肉鸡肠道的绒毛高度和V/C 比值，降低了隐窝深度。说明丁酸梭菌对肉鸡肠道发育有促进作用，间接增强营养物质在消化道中的吸收作用。其作用机制可能是丁酸作为丁酸梭菌主要代谢产物，是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质，对家禽肠上皮组织的增殖与发育以及维持其形态结构完整性起着重要作用[30]。

3.3 丁酸梭菌对肉鸡肠道免疫和屏障功能的影响

炎症反应具有复杂的调节机制，且过度的炎症反应会对机体造成不可逆的损伤[31-32]。本研究结果显示，与饲喂基础日粮组相比，丁酸梭菌组肉鸡血清 中IL-1β 含 量 及 肠 道 黏 膜TNF-α和IL-1β的mRNA 相对表达量显著降低。同时本研究还发现，丁酸梭菌组肉鸡血清中IL-10 含量、肠黏膜中相对表达量相较于对照组有所上升。李玉鹏等[33]在断奶仔猪试验中也发现，丁酸梭菌可提高仔猪血清中IL-10含量，降低血清中IL-1β含量。这可能是由于本研究采用高密度饲养模式，高密度饲养会导致肉鸡机体产生炎性反应[3]；另外，丁酸梭菌可以缓解应激环境引起的肉鸡机体炎症反应。具体作用机制可能是丁酸梭菌通过激活肠上皮细胞中TLR2/MyD88信号通路，诱导巨噬细胞分泌IL-10，来达到抗炎的效果[34]；或通过调节NF-κB 信号通路，来调控下游基因的表达，从而调节炎症反应[35]。

肠道屏障所包含的肠细胞紧密连接对于肠道的通透性、营养物质的吸收利用、疾病的产生与发展以及抵抗病原菌和毒素的侵入等起着至关重要的作用[36-38]。本研究结果显示，丁酸梭菌组紧密连接蛋白ZO-1和闭合蛋白Claudin-1mRNA 表达水平显著高于对照组。ZONG 等[39]和李玉鹏等[33]研究指出，在断奶仔猪日粮中添加丁酸梭菌可提高肠道紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1mRNA表达量。杨明月[40]在对獭兔的研究中发现，丁酸梭菌可显著提高獭兔肠道总紧密连接蛋白相对表达丰度。在肠道免疫屏障中，肠黏膜sIgA 是主要的免疫球蛋白，作为抵御各种内源性共生菌和外源性病原菌的重要防线。杨彩梅等[41]研究表明，在肉鸡日粮中添加丁酸梭菌，可提高肠黏膜sIgA 含量。郑江平等[42]研究发现，饲料中添加乳酸菌能显著增加肉鸡sIgA 的水平。可见，丁酸梭菌对肉鸡肠道屏障功能有一定的促进作用。其作用机制可能是丁酸梭菌可通过分泌丁酸为肠上皮细胞供能，促进上皮细胞生长和修复[25]。

细胞焦亡是一种炎症程序性细胞死亡过程[43]。细胞焦亡依赖于Caspase-1 的活化，Caspase-1 可介导胞内渗透压净增加，诱导细胞膨大破裂，释放炎性物质；同时，活化的Caspase-1还可以促进pro-IL-1β和pro-IL-18 的成熟，使之形成有活性的IL-1β 和IL-18[44-45]。本研究中，丁酸梭菌组肉鸡血清中Caspase-1、IL-1β 和IL-18 含 量 及 肠 黏 膜 中 其mRNA 表达量显著下降。由此推测，丁酸梭菌可缓解肉鸡细胞炎性焦亡的发生，其具体机制还有待进一步研究。

综上，日粮中添加1×109cfu/kg丁酸梭菌能提高肉鸡的生长性能和饲料利用率，改善肉鸡肠道形态，提升肠道屏障功能，并能在一定程度上缓解肉鸡的肠道细胞焦亡。