姜黄素微乳凝胶的制备及体外抗炎抑菌研究

杜 丽，韩 笑，高旭辉，杜 艳(山西省肿瘤医院，中国医学科学院肿瘤医院山西医院，山西医科大学附属肿瘤医院药学部，太原 03003；山西医科大学药学院；通讯作者，E-mail:dulinhui-004@63.com)

姜黄素(curcumin， CUR)是从姜科姜黄属(CurcumaL.)植物姜黄的根茎中提取的一种化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化的功效[1]，但由于姜黄素极难溶于水，导致其口服吸收差，生物利用度低，限制其在临床的应用[2]。

微乳凝胶是将药物与一定比例的油、乳化剂、助乳化剂和水制备得到微乳，然后加高分子载体材料制备成凝胶的制剂[3]，能够改善药物水溶性，提高其生物利用度。目前市售的药品中，没有CUR微乳及微乳凝胶的制剂。本研究在前期实验基础上，制备CUR微乳，并进一步考察凝胶制备工艺，以改善CUR水溶性，提高药物生物利用度，为制备CUR皮肤外用制剂进行初步探索；并对所得制剂进行小鼠耳肿胀抗炎研究、对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌及大肠杆菌体外抑菌研究，为深入探讨CUR微乳凝胶的抗炎抗菌效果提供理论依据。

1 仪器、试剂与动物

UV-1200紫外分光光度仪(上海美谱达仪器有限公司)；HC-2064型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；NDJ-5S数显黏度计(上海衡平仪器仪表厂)。

CUR原料药(批号：20160508，纯度为99%，罗恩化学试剂有限公司)；卡波姆940(食品级，河南万邦实业有限公司)；肉桂油、曲拉通X-100(OP)(均为天津市登峰化学试剂厂)；色谱级甲醇、聚乙二醇400(天津科密欧化学试剂有限公司)；丙三醇(天津市大茂化学试剂厂)；三乙醇胺、甲醇分析纯(天津市北辰方正试剂厂)；二甲苯(济南大晖化工科技有限公司)；扶他林乳膏(北京诺华制药有限公司)；尼泊金甲酯(山东萍聚生物科技有限公司)。

小鼠(昆明属，SPF级)，9只，来源于山西医科大学实验动物中心，合格证号：SYXY(晋)2020-0001，雄性♂，体质量(20±2)g，年龄为8周左右。本实验已通过山西省肿瘤医院实验动物福利伦理委员会批准(批准号20210345)。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)与绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)均由山西医科大学汾阳学院微生物实验室提供。

2 方法与结果

2.1 CUR微乳的制备

按照本课题组前期的研究，称取肉桂油0.2 g，曲拉通X-100(OP)0.53 g，聚乙二醇(PEG)400 0.27 g，搅拌混合均匀，加CUR 25 mg，搅拌溶解，逐滴加蒸馏水4 g，不断搅拌乳化得到CUR微乳。

2.2 CUR微乳凝胶的制备

先制备CUR微乳，加卡波姆-940适量，甘油适量，调pH至6.0。

2.2.1卡波姆-940用量考察分别考察卡波姆-940用量(质量百分比g/g)为0.5%，0.8%，1.0%，1.2%，1.5%，2.0%，2.5%对CUR微乳凝胶外观及黏度等指标的影响[4]。使用数显黏度计，按中国药典2020版规定方法测定黏度。

结果表明，卡波姆-940用量为1.5%时，所得微乳凝胶的外观澄清透明，制剂成型性良好，黏稠度适中，涂展性较好(见表1)。因此确定卡波姆-940用量为处方量的1.5%，即0.075 g。

表1 CUR微乳凝胶中卡波姆用量考察结果Table 1 Study on carbopol dosage in CUR microemulsion gel

2.2.2 甘油用量考察 其他处方条件不变，分别考察甘油占处方总质量百分比(g/g)为0，3.0%，5.0%，8.0%，10.0%，12.0%时，CUR微乳凝胶外观及黏稠度等指标的变化[4]。结果表明，甘油用量为0～10.0%时，所得制剂外观性状、黏稠度、油腻感和涂展性差别不大，而黏度值有所差别，当甘油用量为10.0%时，黏度为5 066 mPa·s，大小适中(见表2)，因此确定甘油用量为处方量的10%，即0.5 g。

表2 CUR微乳凝胶中甘油用量考察结果Table 2 Study on glycerol dosage in CUR microemulsion gel

2.3 pH值考察

其他处方条件不变，分别考察三乙醇胺调节pH为5.5，6.5，7.5，8.0时对CUR微乳凝胶外观及黏稠度等指标的影响。结果表明，当pH为5.5时，制剂黏度值为5 066 mPa·s，大小适中，通过外观评判，所得制剂外观澄清透明，成型性良好，黏稠度适中，涂展性好(见表3)。因此，最终确定pH为5.5。

表3 CUR微乳凝胶中pH用量考察结果Table 3 Study on pH in CUR microemulsion gel

2.4 CUR微乳凝胶最佳处方确定

称取肉桂油0.2 g，乳化剂OP 0.53 g，PEG400 0.27 g，搅拌混合均匀，加CUR25 mg，搅拌溶解，逐滴加蒸馏水4 g，不断搅拌乳化制备微乳，加入卡波姆-940 0.075 g(1.5%)，甘油0.5 g(10%)，加三乙醇胺调节pH为5.5，最终制备得到CUR微乳凝胶。

2.5 CUR微乳凝胶的含量测定

分别取3批CUR微乳凝胶(20210430，20210501，20210502)各0.12 g，置于10 ml量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度，混匀，取500 μl至10 ml容量瓶，定容至刻度。过微孔滤膜，进液相20 μl，测定A。根据标准曲线计算CUR微乳凝胶中的药物质量浓度。结果显示，3批CUR微乳凝胶中含CUR分别为4.68，4.53，4.50 mg/g，含量均值±标准差为(4.57±0.01)mg/g，RSD为3.5%(n=3)。

2.6 CUR微乳凝胶的稳定性考察

2.6.1 高速离心实验 取3批自制的CUR微乳凝胶(批号:20210430，20210501，20210502)适量，分别置于离心管中，3 500 r/min离心15 min，结果3批CUR微乳凝胶，无油水分离等不稳定现象，表明高速离心稳定[5]。

2.6.2 耐寒实验 取3批CUR微乳凝胶适量，于-5 ℃冰箱中放置24 h，取出后恢复至室温，然后观察，结果见表4。结果表明，CUR含量与耐寒实验前的含量无差异[(4.56±0.10)mg/gvs(4.57±0.01)mg/g，P>0.05]，表明制剂耐寒稳定性良好[5]。

表4 制剂耐寒实验结果Table 4 Cold resistance test results of the

2.6.3 耐热实验 取3批CUR微乳凝胶适量，于45 ℃水浴锅中放置24 h，取出后冷却至室温。结果表明，各项指标与实验前无明显差异(见表5)。采用配对t检验，CUR含量与耐热实验前的含量相比，有所下降[(4.08±0.07)mg/gvs(4.57±0.01)mg/g，P<0.05]，表明CUR微乳凝胶不耐热，应置于阴凉处贮存。

表5 制剂耐热实验结果Table 5 Hot resistance test results of the

2.7 CUR微乳凝胶的抗炎功效评价

2.7.1 二甲苯所致小鼠耳肿胀研究 按照文献[5]所述方法，取昆明种小鼠9只，从笼中随机选取小鼠分为3组，每组3只：生理盐水组、扶他林乳膏组、CUR微乳凝胶组。生理盐水组每只小鼠给生理盐水0.2 ml，扶他林乳膏组和CUR微乳凝胶组每只小鼠给药0.2 g，小鼠连续给药3 d，每天给药2次，于末次给药1 h后小鼠右耳廓内外侧均匀涂抹二甲苯30 μl，左耳为自身对照，致炎30 min后颈椎脱臼处死小鼠，剪下耳朵，用打孔器(直径6 mm)于双耳对称部位取下圆耳片，称重，计算小鼠耳廓肿胀抑制率(%)。小鼠耳廓肿胀抑制率(%)=[(C0-Ct)/C0]×100%，C0为阴性对照组平均耳廓肿胀度；Ct为给药组平均耳廓肿胀度。

采用SPSS12.0软件进行方差分析比较三组之间是否有差异，然后采用Dunnett’st检验比较两组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。由表6可知，与生理盐水组相比，CUR微乳凝胶组二甲苯致小鼠耳肿胀度能显著降低(P<0.05)，对小鼠耳肿胀抑制率为55.27%，表明CUR微乳凝胶具有抗炎作用。

表6 CUR微乳凝胶对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响Table 6 Effect of CUR microemulsion gel on auricle swelling induced by xylene in

2.7.2 CUR微乳凝胶的抑菌效果评价 参考资料[5]所述方法，实验分为3个组，空白微乳凝胶基质组作为阴性对照、0.4%尼泊金甲酯组作为阳性对照、CUR微乳凝胶组作为供试品。取琼脂适量，溶解于超纯水，搅拌均匀，加热至沸腾，121 ℃高温高压灭菌30 min，温度降低后分装于灭菌的培养皿备用。抑菌圈实验采用孔洞法，精密吸取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与绿脓杆菌供试菌菌悬液300 μl于无菌培养皿，加入营养肉汤琼脂培养基15～20 ml，混合均匀菌液与培养基，培养基凝固后，等距离打孔，标记，分别精密吸取80 μl的阴性对照、阳性对照与供试品于孔中，轻轻混匀，待凝固后倒扣平板，于37 ℃培养箱中培养，24 h后观察结果，测量抑菌圈直径大小，每种菌平行3组实验，取平均值，采用SPSS12.0软件，进行方差分析比较三组之间是否有差异，然后采用Dunnett’st检验比较两组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。抑菌圈判定标准：抑菌圈直径>20 mm，极敏；15～20 mm，高敏；10～15 mm，中敏；<7 mm，不敏感。

结果显示，与空白微乳凝胶基质组比较，CUR微乳凝胶组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与绿脓杆菌均有显著的抑制作用(P<0.05，见表7)。结果表明，CUR微乳凝胶具有一定的体外抑菌作用。

表7 CUR微乳凝胶的抑菌结果Table 7 Bacteriostatic results of CUR microemulsion

3 讨论

3.1 微乳凝胶的制备实验

目前资料报道的CUR微乳凝胶处方为：CUR7.2 mg，辛葵酸甘油酯3 g，乳化剂OP2.3 g，PEG400 4.7 g，卡波姆-934 0.5 g，三乙醇胺适量，加水至36 g[2]。该文献处方中CUR只有7.2 mg，而本研究的制剂处方中CUR为25 mg，含药量远高于文献报道，本研究进一步优化了制剂处方，提高了制剂含药量。

在制备CUR微乳凝胶过程中，文献采用的方法为：先将卡波姆-934与甘油、水混合，加三乙醇胺调节pH，成凝胶后再与CUR微乳混合，所得制剂含水量较高，制剂黏稠度小[2]。本研究考虑微乳中和凝胶剂中均含有水分，会降低制剂黏稠度。为了使制剂黏稠度适中，本研究在CUR微乳中直接加卡波姆-940、甘油，加三乙醇胺调节pH制备成CUR微乳凝胶。所得产品性能优良，外观澄清透明，涂展性好，黏稠度适中。方法步骤较文献简化，所得产品性能优于文献报道。

3.2 抗炎抑菌实验

CUR具有抗炎抑菌的效果，但由于其水中溶解度差的问题，影响其应用。本实验将CUR制备成微乳凝胶后，适合在皮肤局部进行使用。该制剂淡黄色，均匀细腻，具备微乳和凝胶的双重特性，增加了CUR的溶解度，方便于局部皮肤释放药物，生物相容性和稳定性良好。而且经过小鼠二甲苯耳肿胀实验和抑菌实验的研究表明，CUR微乳凝胶具有一定的抗炎抑菌效果，为其制剂的开发研究奠定理论基础。