基于LCS探讨重组人TGF-β2对HTF细胞增殖及转分化的作用

王丽君，邵美琳，李宏松，任梅梅，王建明(西安交通大学第二附属医院眼科，西安 710004;通讯作者，E-mail:xajdwjm@163.com)

滤过道纤维化瘢痕是导致青光眼滤过术(glaucoma filtration surgery，GFS)手术失败的主要原因[1，2]。人Tenon’s囊成纤维细胞(human Tenon’s capsule fibroblasts，HTF)转分化为肌成纤维细胞及细胞增殖激活是导致GFS术后组织纤维化瘢痕形成的关键因素[3-5]。滤过道瘢痕的形成机制涉及多种细胞因子，其中转化生长因子-β2(transforming growth factor-beta 2，TGF-β2)是导致GFS术后纤维化瘢痕形成最重要、最有效的细胞因子，也是目前研究GFS术后纤维化的重要关注点[3，6，7]。TGF-β有3个亚型：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，均与组织伤口愈合有关，TGF-β2是主要的眼部亚型，是引发结膜组织瘢痕化的有力刺激[8-10]。TGF-β2可以激活间质细胞HTF，刺激HTF增殖，诱导HTF转分化为以α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)高表达为关键特征的肌成纤维细胞，导致组织收缩及增生性瘢痕[11，12]。因此在滤过道纤维化瘢痕的离体细胞研究中常采用TGF-β2诱导建立HTF纤维化瘢痕模型[3，4，12]，但目前尚无统一的TGF-β2作用浓度、时间等实验条件以建立HTF纤维化瘢痕细胞模型。其次，相对于活细胞工作站(live cell station，LCS)，MTT、CCK-8等传统检测细胞增殖的实验是通过细胞活性间接反映某个时间节点的细胞增殖活性，并不是直接检测细胞增殖情况，而LCS用于检测TGF-β2对HTF作用的研究尚未见报道。本实验旨在基于LCS分析系统研究不同剂量重组人TGF-β2对HTF增殖、转分化的作用及机制，以探索建立体外HTF纤维化瘢痕细胞模型的最佳实验条件，为GFS术后纤维化瘢痕机制的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胎牛血清(FBS，购自美国Gibco公司)，DMEM培养基(购自美国HyClone公司)，重组人TGF-β2(购自美国PeproTech公司)，CCK-8(购自日本Dojindo公司)，细胞周期检测试剂盒(购自上海碧云天公司)，兔源α-SMA单克隆抗体(购自美国Abcam公司)，鼠源增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体、鼠源纤连蛋白(fibronectin，FN)单克隆抗体(购自美国Santa Cruz公司)，鼠源GAPDH单克隆抗体、HRP山羊抗兔二抗、HRP山羊抗鼠二抗(购自美国Proteintech公司)。

主要仪器：全自动活细胞工作站系统(购自美国BioTek公司)，ECL凝胶成像仪(购自美国Bio-rad公司)，酶联免疫检测仪(德国BMG LABTECH公司)，流式细胞仪(美国ACEA Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代HTF的离体培养 采集我院眼科斜视手术患者的Tenon’s囊组织，患者无全身及其他眼部疾病史，年龄小于18岁。研究涉及人体组织取材，已通过西安交通大学第二附属医院伦理委员会审批[审批号：(2019)伦审一研第(014)号]。根据前期文章[13]所述方法进行HTF的分离、原代培养及鉴定。37 ℃、5% CO2培养箱中培养细胞，采用含10% FBS的DMEM培养液进行HTF的传代培养，取3～7代对数生长期的HTF进行后续实验。

1.2.2 细胞分组及处理 0 ng/ml的TGF-β2组：含2% FBS的DMEM培养液培养HTF；不同浓度TGF-β2组：含1，5，10，20，100 ng/ml TGF-β2的2% FBS DMEM培养液培养。

1.2.3 CCK-8检测细胞活性 CCK-8检测0，1，5，10，20，100 ng/ml TGF-β2处理48 h对HTF细胞活性的影响。调节HTF细胞浓度为3×103个/100 μl，以100 μl/孔接种至96孔板中，每组设5个平行复孔，干预结束后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培养箱内孵育2 h。酶标仪测定450 nm下的吸光度。细胞相对活性率=(处理组吸光度值-对照组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。

1.2.4 活细胞工作站分析系统分析细胞增殖率 全自动活细胞工作站(LCS)系统(包含Cytation5细胞呈像微孔板检测系统)分析0，1，5，10，20，100 ng/ml TGF-β2处理0，12，24，48，72 h对细胞增殖率的影响，并拍照记录细胞形态变化。BioTek活细胞工作站系统可以通过检测细胞数量随时间的变化而分析细胞增殖情况，并且检测全程无需额外添加检测试剂，即对细胞生长增殖状态和活性无额外干预。调节HTF浓度为1×103个/200 μl，以200 μl/孔接种至96孔板中，每组设5个平行复孔。各组分别给与相应的干预措施，BioTek活细胞工作站系统分析各组细胞在0，12，24，48，72 h时细胞数量的变化。细胞相对增殖率=(处理组不同检测时间细胞数/处理组细胞数0 h-对照组不同检测时间细胞数/对照组细胞数0 h)/(对照组不同检测时间细胞数/对照组细胞数0 h)×100%。细胞相对增殖率大于0表示相对于0 ng/ml的TGF-β2组是促进增殖，细胞相对增殖率小于0表示相对于0 ng/ml的TGF-β2组是抑制增殖。

1.2.5 Western blot检测目的蛋白PCNA、α-SMA、FN HTF细胞给与0，5，10，20 ng/ml TGF-β2处理干预48 h，干预结束后提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。各组取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白湿转至PVDF膜上，室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，所用一抗GAPDH(1 ∶50 000)、PCNA(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶400)、FN(1 ∶200)，室温孵育二抗(1 ∶5 000)1 h。ECL发光观察目标蛋白，BioRad凝胶成像系统成像。目标蛋白的灰度值由Image J软件测量。

1.2.6 流式细胞术碘化丙啶染色检测细胞周期 碘化丙啶(propidium，PI)染色后，G2/M期细胞的荧光强度是G0/G1期细胞荧光强度的2倍，S期细胞的荧光强度介于G0/G1期和G2/M期之间，通过流式细胞术检测细胞荧光强度分析细胞周期。6孔板中待HTF生长融合率至70%～80%时给与0，5，10，20 ng/ml TGF-β2处理干预48 h，干预结束后胰酶消化HTF，收集细胞于EP管中，1 000g离心5 min，预冷PBS重悬洗涤HTF，1 000g离心5 min，4 ℃预冷的70%酒精固定HTF过夜，1 000g离心5 min，预冷PBS重悬洗涤HTF，1 000g离心5 min，加入碘化丙啶染色液，每份样品含0.5 ml染色缓冲液、25 μl PI染色液(20×)、10 μl RNase A(50×)，37 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪在488 nm波长处检测荧光强度，评估细胞DNA含量分析细胞周期。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度TGF-β2对HTF细胞活性的影响

采用CCK-8检测细胞活性，通过TGF-β2干预后细胞相对活性率的变化评价不同浓度TGF-β2对HTF的细胞毒性作用。结果显示，与0 ng/ml比较，10 ng/ml的TGF-β2干预可显著提高HTF的细胞活性率，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)，1～100 ng/ml的TGF-β2干预48 h均未显著抑制HTF的细胞活性(P>0.05)，提示1～100 ng/ml的TGF-β2对HTF无明显细胞毒性作用。

与0 ng/ml的TGF-β2比较，*P<0.05图1 CCK-8检测不同浓度TGF-β2对HTF细胞活性的影响 (n=3)Figure 1 Effect of different concentrations of TGF-β2 stimulation on cell viability of HTF by CCK-8 (n=3)

2.2 活细胞工作站系统动态分析不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖率及细胞形态的影响

为了研究不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖率的影响，采用活细胞工作站(LCS)分析系统分析细胞数量的变化并计算细胞相对增殖率。TGF-β2诱导处理使HTF的细胞相对增殖率增加，与0 ng/ml比较，5，10 ng/ml的TGF-β2干预时显著促进HTF增殖，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)，其中干预48 h时TGF-β2的促增殖作用最为显著(P<0.05)，因此在后续研究中采用TGF-β2干预细胞48 h进行研究。

同时间与0 ng/ml的TGF-β2组比较，*P<0.05图2 不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖率的影响 (n=3)Figure 2 Effect of differen concentrations of TGF-β2 on proli-feration rate of HTF (n=3)

0 ng/ml的TGF-β2干预下HTF呈长梭形、多角形，1 ng/ml的TGF-β2对细胞形态及密度的影响不明显，大于5 ng/ml的TGF-β2干预可使细胞体积增大、胞浆丰富，5，10，20 ng/ml TGF-β2干预组细胞密度增加，其中10 ng/ml TGF-β2干预组细胞密度增加最显著(见图3)。

图3 不同浓度TGF-β2对HTF细胞形态的影响 (bar=100 μm)Figure 3 Effect of different concentrations of TGF-β2 on cell morphology of HTF (bar=100 μm)

2.3 不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖指标PCNA蛋白表达量的影响

采用Western blot检测分析不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖指标PCNA表达量的影响。Western blot分析显示，与0 ng/ml的TGF-β2相比，5 ng/ml及10 ng/ml的TGF-β2干预可显著提高HTF细胞PCNA的表达量(P<0.05)，20 ng/ml的TGF-β2干预对HTF细胞PCNA表达量的影响无显著差异(P>0.05，见图4)，提示5，10 ng/ml的TGF-β2干预促进HTF增殖指标PCNA的表达。

与0 ng/ml的TGF-β2比较，*P<0.05图4 不同浓度TGF-β2对HTF细胞增值指标PCNA蛋白表达的影响 (n=3)Figure 4 Effect of different concentrations of TGF-β2 on PCNA protein expression in HTF (n=3)

2.4 不同浓度TGF-β2对HTF细胞周期的影响

为了进一步研究TGF-β2促进HTF增殖的具体作用途径及机制，采用流式细胞术分析不同浓度TGF-β2对HTF细胞周期的影响。细胞周期的分析结果显示，5，10 ng/ml的TGF-β2组细胞G0/G1期的比例较0 ng/ml的TGF-β2组降低(P<0.05)，S期的比例较0 ng/ml的TGF-β2组增加(P<0.05)；各组G2/M期所占比例无显著差异(P>0.05，见图5)。以上结果提示5，10 ng/ml的TGF-β2干预通过促进细胞进入S期增加增殖期细胞的比例，进而促进HTF细胞增殖。

图5 不同浓度TGF-β2对HTF细胞周期的影响 (n=3)Figure 5 Effect of different concentrations of TGF-β2 on cell cycle of HTF (n=3)

2.5 不同浓度TGF-β2对HTF细胞转分化指标α-SMA和FN蛋白表达的影响

采用Western blot检测分析不同浓度TGF-β2对HTF细胞转分化指标α-SMA和FN表达量的影响。Western blot分析显示，与0 ng/ml的TGF-β2相比，5，10，20 ng/ml的TGF-β2干预可显著提高HTF细胞α-SMA和FN的表达量(P<0.05，见图6)，提示5～20 ng/ml的TGF-β2干预促进HTF细胞转分化。

与0 ng/ml的TGF-β2比较，*P<0.05图6 不同浓度TGF-β2对HTF细胞转分化指标α-SMA、FN蛋白表达的影响 (n=3)Figure 6 Effect of different concentrations of TGF-β2 on the expression of SMA and FN proteins in HTF (n=3)

3 讨论

TGF-β2是导致GFS术后纤维化瘢痕形成的关键细胞因子，GFS术后房水中TGF-β2表达增加，活性TGF-β2比例增加，滤过泡中TGF-β2及其受体的表达显著升高，同时，GFS术后结膜纤维化组织中的TGF-β2表达上调[3，14，15]。TGF-β2诱导HTF转分化为肌成纤维细胞参与GFS术后组织愈合，HTF转分化、增殖激活是导致GFS术后纤维化瘢痕的关键因素[3-5，16]。本研究基于LCS分析系统采用不同浓度TGF-β2诱导处理HTF，探究不同浓度TGF-β2对HTF增殖、转分化的作用及机制，以确定体外建立HTF纤维化瘢痕细胞模型的最佳实验条件。

在TGF-β2刺激下，HTF转分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞具有复杂的收缩蛋白，α-SMA高表达为关键特征[3，12]，细胞的收缩活性、迁移能力增强，并且伴随着FN、胶原等细胞外基质的产生和分泌[17]。在GFS术后伤口的愈合过程中，肌成纤维细胞合成、分泌过量的ECM，并通过收缩在ECM上施加牵引力，导致组织结构扭曲，随后形成纤维化瘢痕[18]。在正常生理条件下，肌成纤维细胞随创面愈合而凋亡，但在病理性伤口愈合过程中，肌成纤维细胞持续存在，导致组织收缩及增生性瘢痕[11]。因此，HTF活化后的转分化是GFS术后组织纤维化发生的关键，α-SMA、FN是评价HTF转分化为肌成纤维细胞的重要指标。本研究中大于5 ng/ml的TGF-β2干预可使细胞体积增大、胞浆丰富，5～20 ng/ml的TGF-β2干预通过增加α-SMA和FN的表达有效促进HTF细胞转分化。

TGF-β2诱导的HTF增殖激活也是GFS术后组织纤维化瘢痕形成的关键因素[3]。细胞的增殖活性增强表现为细胞数量的增多，以及增殖期细胞比例的增加。本研究中采用BioTek活细胞工作站(LCS)分析系统检测细胞数量变化以分析不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖率的影响，该系统通过检测细胞数量随时间的变化来分析细胞增殖情况，具有实时、自动、检测、分析的优点，并且检测全程无需额外添加检测试剂，对细胞生长状态和活性无额外影响，即一次干预实验后就可检测细胞在干预后12，24，48，72 h细胞数量的变化情况。在结果分析时均分析各组相对于各自0 h的细胞增殖情况，这样相对于MTT、CCK-8、EdU检测减少了细胞及试剂的使用量，减少了多次人为操作所带来的误差。本项研究也是首次采用LCS系统研究不同浓度TGF-β2对HTF细胞增殖的影响。本研究结果显示1～10 ng/ml的TGF-β2诱导可引起HTF细胞增殖率的增加，且促进增殖的作用随着TGF-β2浓度增加而增强，TGF-β2干预48 h促HTF细胞增殖作用稳定，而TGF-β2浓度大于10 ng/ml时促HTF增殖作用减弱。本研究结果同时表明LCS系统是研究TGF-β2对HTF细胞作用的可靠方法。LCS分析结果显示TGF-β2浓度在5，10 ng/ml时促进HTF细胞增殖的作用均具有统计学意义(P<0.05)，细胞增殖指标PCNA检测结果及细胞周期分析结果同样显示TGF-β2浓度在5，10 ng/ml时促进HTF细胞增殖的作用均具有统计学意义(P<0.05)，说明LCS系统是分析HTF增殖率的有效方法，且具有连续检测、省时的优越性。

增殖期细胞比例的增加也是细胞增殖活性增加的重要特征。细胞周期S期和G2/M的比例增加代表增殖期细胞比例增加。本研究中通过PI染色流式细胞术分析细胞周期，PI与双链DNA结合后可以产生荧光，通过检测荧光强度可以评估细胞DNA含量并分析细胞周期，G2/M期细胞的荧光强度是G0/G1期细胞的2倍，S期细胞的荧光强度介于两者之间。PCNA是细胞周期早期G1期和S期合成的一种蛋白质，主要在细胞核表达，参与细胞周期进程、DNA复制和DNA修复，是评估细胞增殖的重要生物标记物[19，20]。本研究结果证明5～10 ng/ml的TGF-β2通过增加PCNA表达量促进细胞进入S期增加增殖期细胞的比例，进而促进HTF细胞增殖。

综上所述，LCS系统是研究TGF-β2对HTF细胞作用的有效方法，5～10 ng/ml的TGF-β2有效促进HTF细胞转分化，通过增加PCNA表达量促进HTF进入S期增加增殖期细胞的比例，进而促进HTF细胞增殖。因此，推荐5～10 ng/ml的TGF-β2干预48 h建立HTF纤维化瘢痕细胞模型。