自噬相关蛋白在牙周病发生发展中作用的研究

郝 鸿

（华中科技大学医院，湖北 武汉 430074）

牙周病是指由牙菌斑的刺激产物引起的牙周组织炎性疾病。牙周病会破坏牙支持组织，会导致牙龈红肿、疼痛、出血，进一步发展后可导致牙槽骨的吸收，继而导致牙齿松动、移位、脱落。正常情况下，自噬是一种常见的细胞现象，既能抑制也能促进细胞凋亡，这两种反应在生物体内均广泛存在。在营养缺乏时，自噬反应是一个细胞的促活反应机制，但是过度的自噬反应也会导致细胞死亡[1]。口腔卫生不佳时，大量的细菌会影响牙周生态系统；一旦细菌数量过多，牙龈上皮细胞会处于相对营养匮乏的状态，这极易导致其死亡。有研究[2-3]表明，自噬相关蛋白与牙周病的发生发展密切相关。本文针对自噬相关蛋白在牙周病发生发展中的作用进行初步探讨。现报告如下：

1 研究资料及方法

1.1 研究资料

选取我院近3 年（2019 年1 月至2022 年1 月期间）收治的牙周病患者86 例作为观察组，选择同期在我院进行同牙位正畸治疗但牙周健康的患者30 例作为对照组。回顾分析两组的临床资料。观察组：男47 例，女39 例；年龄20 ～55 岁，平均（37.54±2.16）岁。对照组：男17 例，女13 例；年龄21 ～53 岁,平均(37.23±2.36)岁。两组的基本资料相比均衡性良好(P＞0.05) ，有可比性。

1.2 方法

两组患者均分别采集牙周袋标本：采集菌斑，选择吸潮纸，蘸取龈沟液，放入牙周袋15 s 后取出，剪下尖端放入离心管。将采集的样本放入灭菌PBS 中保存（-20℃）。实验室检测方法：离心，弃上清，加入1 mL 胶原酶；放入孵育箱45 min(每5 min 振荡1 次)；离心，弃上清，用10% 胎牛血清培养液冲洗，重复3次。吸出组织块，种入培养瓶（含有2 mL 20% 胎牛血清培养液）中。加入500 μL 20% 胎牛血清培养液，待细胞从组织块中游出，然后再添加培养液。置于显微镜下观察。使用1 mg/L 脂多糖刺激上述细胞，引起致炎反应，作用时间为48 h。

1.3 观察指标及判定标准

两组均应用免疫组织化学染色法检测微管相关蛋白1 轻链3 B（LC3B）、微管相关蛋白1 轻链3 Av1（LC3Av1）的表达情况。方法是：（1）蛋白样本的制备。以细胞胰酶对样本进行消化离心，弃上清，加入NP-40 裂解液。经超声充分裂解后，以15000 r/min的速度离心5 min，取上清液。以BCA 法测定蛋白浓度。（2）蛋白质印迹：经15% SDS-PAGE 电泳使蛋白转移至PVDF 膜上，以5% 脱脂奶粉封闭，用PBS-T 漂洗3 次。加入1:5000 稀释兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1抗体，4℃孵育过夜后，用PBS-T 漂洗3 次。再分别加入带有荧光基团标记的稀释抗兔二抗、抗鼠二抗，孵育60 min，用PBS-T 漂洗3 次。最后镜下观察并摄片。（3）细胞免疫荧光染色。细胞用4%甲醛固定后，行PBS 漂洗，继而用3% 过氧化氢甲醇乳液孵育。封闭渗透30 ～45 min，用PBS 清洗3 次，一抗为1:5000稀释兔抗LC3B、兔抗鼠LC3Av1 抗体，4℃孵育过夜；行PBS 清洗，加入1:2000 稀释抗兔二抗，置入SP-9001C 液中室温避光孵育60 min ；行PBS 清洗，以DAPI 工作液(1 mg/L) 进行细胞核染色，保持15 min后行PBS 清洗，封片剂封固。以荧光显微镜观察取像。

1.4 统计学方法

用统计学软件（SPSS 23.0 版本）分析数据。计量资料用均数± 标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ² 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 致炎反应作用后两组LC3B 的表达情况

本研究的结果显示，经免疫组织化学染色处理后，对照组、观察组（0 h）样品组织中均可见LC3B 的表达。脂多糖刺激6 h、12 h 后，对照组的LC3B 阳性表达率较低，而观察组的LC3B 阳性表达率较高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，观察组的LC3B 阳性表达率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，观察组的LC3B阳性表达率增加，24 h、48 h 后有所下降。观察组各时间段的LC3B 阳性表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 致炎反应作用后两组LC3B 的表达情况[例(%)]

2.2 致炎反应作用后两组LC3Av1 的表达情况

本研究的结果显示，经免疫组织化学染色处理后，对照组、观察组（0 h）样品组织中均可见LC3Av1 的表达。脂多糖刺激6 h、12 h 后，对照组的LC3Av1阳性表达率较低，而观察组的LC3Av1 阳性表达率较高；脂多糖刺激24 h、48 h 后，观察组的LC3Av1 阳性表达率降低。提示在脂多糖刺激6 h、12 h 后，观察组的LC3Av1 阳性表达率增加，24 h、48 h 后有所下降。观察组各时间段的LC3Av1 阳性表达率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 致炎反应作用后两组LC3Av1 的表达情况[例(%)]

3 讨论

牙周病是一种慢性细菌感染性疾病。该疾病的早期症状不易引起重视，等到有自觉症状时，它已进展至较为严重的程度，主要症状表现为牙龈红肿、肥大或萎缩，严重者可致牙齿松动、咬合无力、持续钝痛等。如不及时治疗，可造成牙齿移位、脱落，严重影响健康[4-5]。目前临床上公认菌斑是牙周病的致病因子。牙周病患者在早期往往没有明显的自觉症状，随着病情的进展，很多患者会出现刷牙时牙龈出血的情况，有些患者还会出现牙龈肿胀不适、口腔异味等症状。如果病情不能得到有效控制，牙周病的症状会表现得越来越明显，继而出现牙龈肿痛、牙齿松动、牙龈“萎缩”、牙齿移位、咀嚼无力等症状，到疾病的晚期牙齿可能会自行脱落[6]。在免疫反应中，当自噬发生时，细胞溶质的成分会被降解，细胞胞质中会形成具有双层膜杯状分隔膜的自噬前体，溶酶体分隔膜不断延伸，并逐步包裹细胞垃圾，形成密闭的自噬体囊泡。它可降解其包裹的细胞成分，并循环再利用降解产物。同时细胞自噬能为细胞部件提供燃料，供应能量，或提供材料来更新细胞部件。目前，临床上已鉴定出许多自噬相关基因，且证实了细胞自噬在进化上具有高度保守性，其自噬机制和生理功能也得到了深入的研究。现代研究发现自噬的作用很多，包括改善免疫、代谢、内分泌、抗炎、提高线粒体效能、对抗感染、预防阿尔兹海默症等退行性疾病、抑制肿瘤细胞等有益作用。LC3 是自噬研究中常用的检测指标之一。当自噬形成时，LC3-Ⅰ可转变为LC3- Ⅱ，继而参与膜的延伸。在自噬过程中，LC3- Ⅰ在ATG7 和ATG3 泛素样反应下参与活动，并与磷脂酰乙醇胺偶联，继而生成脂质化形式的LC3-Ⅱ。LC3- Ⅱ由于磷脂酰乙醇胺的修饰，导致电荷变化，使得其迁移更快，所以在SDS-PAGE 中显得分子量比LC3- Ⅰ小。但由于ATG4B 仅存在于自噬早期阶段的双层膜上，且LC3在自噬过程中不断被切割和降解，所以很难单纯根据此指标判断机体自噬是否被激活或抑制[7-8]。LC3- Ⅱ增多时，自噬活性增强，其被广泛作为细胞自噬标志物。LC3- Ⅰ/ Ⅱ的形成和降解是一个动态过程[9]。牙周病患者外周血肿中自噬相关蛋白LC3B、LC3Av1 的表达水平明显增高，可见自噬在其疾病的发生、发展中发挥了重要的作用[10]。LC3B 作为LC3 家族蛋白，是LC3 的一种，其同样可以用作自噬的分子标志。通过使用抗LC3B 抗体检测LC3B，可以大大增加相关实验的成功率。我们通过使用1 mg/L 脂多糖刺激样品细胞，在诱导或抑制后，观察自噬过程，并检测LC3Av1的表达水平。结果发现，无论是炎性细胞还是正常细胞都保持一定的自噬活性。而在牙周病患者的外周血肿中自噬相关蛋白LC3B、LC3Av1 的表达水平明显增高。牙周病的病因包括局部因素和全身因素，两者之间有密切的关系。例如牙结石的致病因素主要是表面形成的未钙化菌斑的刺激及牙结石本身坚硬粗糙，对牙龈造成机械刺激；牙面色素有助于提供菌斑积聚和刺激牙龈的粗糙表面，继而造成牙周组织炎症，临床研究多认为该因素可作为评估口腔卫生情况和相关微生物增殖情况的指标。食物被咬合压力楔入相邻两牙的间隙内，是局部牙周组织被破坏最常见的原因之一。嵌塞的机械作用及细菌的定植，除可引起牙龈组织的炎症及出血外，还可以引起牙龈退缩、牙槽骨吸收和口臭等。咬合关系不正常或咬合力量不协调可引起牙周支持组织损伤，当咬合力超过牙周组织的承受范围时，就有可能造成牙周组织的损伤。上述因素均会引起口腔感染，继而导致细胞自噬的激活。在脂多糖的刺激下LC3 蛋白表达增多，表明自噬增强，提示自噬可参与牙周炎的病理发展。但具体起着保护作用还是病理作用，尚无充分的证据证实，只能提示自噬与牙周炎相关。在荧光显微镜下观察自噬形成，可见多个明亮的绿色荧光斑点，故可采用计数法来评价自噬活性的高低。荧光显微镜是以紫外线为光源，在显微镜下可照射被检物体，使之发出荧光，从而观察物体的形状及其所在位置。临床中荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。一些物质本身虽不能发出荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发出荧光。在荧光显微镜技术中，将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入样本细胞中，可以将产生的绿色荧光蛋白基因与某种蛋白质基因融合，便可直接在活体状态下观察到该蛋白在活细胞内的动态变化。LC3 的荧光显微镜检测方法仍存在一些缺陷，比如临床还没有建立起统一标准的试验技术路线，试验者执行操作还不够规范；检验中荧光斑细胞比例和表达的量化路径较缺乏。再比如定量单个细胞LC3 荧光斑的表达中，计算每个转染细胞的平均荧光值中还没有确切的量化标准；因为LC3 荧光斑具有较高的时间依赖性，长时间下可能会导致其蓄积，加之各种环境因素、操作技术均会影响检测结果，从而造成结果误差。所以优化相关检测技术，深入研究更符合自噬生理学功能的检测技术具有重要的意义。目前，越来越多的研究表明自噬会参与牙周病的发病机制，但LC3B、LC3Av1 在牙周病发生发展中的作用机制还需进一步在相关细胞实验中探讨分析。本研究的结果显示，在脂多糖的刺激下，自噬相关蛋白LC3B、LC3Av1 的表达水平会明显上调。这表明，自噬可参与牙周炎发生发展的过程。

综上所述，自噬相关蛋白在牙周病的发生发展中可影响炎性细胞的生成，且表达量随炎症发展而增加。临床上仍需进一步深入研究自噬与牙周病发生发展的关系，继续探讨牙周病发生发展中自噬相关蛋白的表达及作用。