JNK与TGF-β、非经典Wnt信号通路在眼部纤维化中的研究进展

宋 宇，包秀丽

(1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010050;2.内蒙古医科大学附属医院眼科，内蒙古 呼和浩特 010050)

纤维化是机体损伤修复过程中的重要步骤,在一些眼部疾病中，外伤、炎症等常作为始动因素激活细胞内多种信号通路，刺激上皮细胞转发化为间充质细胞，分泌胶原蛋白(Col)、纤连蛋白(FN)等细胞外基质(ECM)，引发视轴的纤维化，最终严重影响患者视力。手术是眼科疾病的主要治疗手段之一，然而术后纤维化的发生仍影响着患者的视力。如何通过更简单、安全、有效的方法阻断眼部术后纤维化的发生成为研究热点。JNK信号通路属于MAPK信号通路的一个重要分支，它与TGF-β、非经典Wnt信号通路共同作用在促进组织损伤修复中发挥着重要作用。多种研究发现，JNK抑制剂可以阻止细胞增殖、迁移、凋亡、上皮间充质转化(EMT)的发生，从而阻断疾病的发生发展。了解JNK信号通路在疾病发病机制中的作用，通过阻断其中某一或某些关键作用点，阻止术后眼内过度纤维化或许可以成为一种治疗的可能。

1 JNK信号通路

1.1 概 述 JNK又称应激活化蛋白激酶(SAPK)，属于MAPK家族。JNK蛋白共有3种表型，其中JNK1、JNK2各有4个亚型，广泛表达于机体各个组织，JNK3有2个亚型，特异性表达于中枢系统、心脏平滑肌和睾丸中[1]。常见的JNK激活物有激素、神经因子、生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)、炎性细胞因子、细胞内外病原体、化学诱导剂等，它们分别与Wnt受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTKs)、TGF-β受体、TNF受体和Toll受体复合物(TLR)等结合，通过“三级”磷酸化的方式激活JNK蛋白，上调c-Jun、ETS样蛋白-1(ELK1)、Smad4、p53、激活转录因子-2(ATF-2)和热休克转录因子-1(HSF1)等靶基因的表达，或抑制活化T细胞核因子C1(NFATC1)、NFAT4和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)等的表达，调控细胞的增殖、分化，促进细胞凋亡，改变细胞的迁移和侵袭力[2]，参与多种肿瘤、纤维化等疾病的发生。由此可见，JNK信号通路能够作为多种信号通路的作用节点广泛应对多种外界刺激，从而参与对机体的调节。

1.2 JNK信号通路的级联反应 JNK信号通路的激活过程是一系列丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化级联反应发生的过程。多种刺激激活位于细胞膜上的Rac、Rho和Cdc42等Rho GTP酶，活化的Rho GTP酶诱导膜近端丝裂原活化蛋白激酶(MAP3Ks)，如MAPK/细胞外信号调节激酶(MEKKs)、细胞凋亡信号调节激酶-1(ASK1)、转化生长因子-β活化激酶-1(TAK1)/TAK1-结合蛋白-1(TAB1)、混合谱系酶-3(MLK3)磷酸化。活化的MAP3Ks同样通过磷酸化的方式诱导丝裂原活化蛋白激酶-4，7(MKK4，7)的激活。MKK7作为JNK的特异性激活剂通过双磷酸化JNK活化环内第Ⅷ亚区的Thr-Pro-Tyr来激活不同亚型的JNK蛋白。被激活的JNK蛋白通过诱导转录因子激活剂激活蛋白-1(AP-1)的活化发挥作用[1,3]。

2 TGF-β、Wnt信号通路对JNK的调节

目前，TGF-β和Wnt信号通路在纤维化疾病的重要作用已被广泛认可。既往研究[4]表明，TGF-β信号和非经典Wnt信号激活相同的MAPK通路，提示JNK与TGF-β、Wnt信号紧密相连，共同影响组织器官纤维化、肿瘤的发生。

2.1 TGF-β对JNK的调节 TGF-β是转换生长因子超家族中的一员，通过调节细胞增殖、迁移和分化的能力，在胚胎发育和组织稳态调节中发挥重要作用，介导恶性肿瘤、炎性疾病和纤维化疾病的发生。TGF-β信号通路可分为Smad依赖途径和非Smad依赖途径。JNK蛋白既可作为TGF-β信号的下游靶点，促进Smad2/3的激活，诱导Bcl2蛋白的磷酸化，降低Bcl2蛋白的表达，促进细胞凋亡，也可被TGF-β非Smad依赖途径激活以发挥作用[5]。TGF-β通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)募集细胞膜上具有3SHc结构域的支架蛋白、生长因子受体结合蛋白-2(Grb2)、鸟苷酸交换因子SOS并激活Ras、Rac和Cdc42，诱导MEKK1/2和支架蛋白POSH介导的JNK信号通路的活化，促进细胞EMT[3]。MAPK/JNK信号通路与TGF-β相互作用共同促进细胞EMT和纤维化发生。MAPK/JNK通路中活化的Ras可促进TGF-β/Smad2信号通路上调整合素α3β1、α2β1、α5β1、αVβ3的表达，改变细胞间黏附，促进波形蛋白(VIM)、FN的表达，下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)的水平，促进ColⅠ、ColⅤ的表达，提高细胞的迁移和侵袭力，促进细胞EMT[6]。MAPK/JNK信号通路也可以调节TGF-β/活化素(Activin)和骨形态发生蛋白(BMP)的活性[7]，影响细胞EMT。

2.2 Wnt/JNK信号通路参与细胞EMT及细胞凋亡 Wnt蛋白在脊椎生物的发育过程中调控着细胞增殖、更新、凋亡，维持器官组织内稳态。根据其作用是否依赖β-catenin，Wnt信号通路分为经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路，后者主要包括Wnt/PCP(Wnt/JNK)和Wnt/Ca2+通路。非经典Wnt蛋白与受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)、Van Gogh样蛋白(Vangl)和卷曲蛋白受体(Fzd)复合物结合，激活蓬乱蛋白(Dvl)介导的Rho/Rac GTP酶、Rho激酶(ROCK)信号激活JNK，促进AP-1、ATF-2等表达，促进球状肌动蛋白(G-Actin)聚合和纤维状肌动蛋白(F-Actin)网形成，调控细胞骨架重塑，促使细胞极性、黏附性、运动力发生改变[8]。Wnt/JNK信号通路还可以介导细胞凋亡。非经典Wnt蛋白在Ror、Vangl的作用下激活Wnt/JNK信号通路，上调Bax/Bcl-2的比值，诱导凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、细胞色素-c(Cyc)的表达启动细胞凋亡。通过降低细胞线粒体膜电位(ΔΨ)，抑制构成线粒体通透性转换孔(mPTP)的关键成分之一VDAC的表达，促进mPTP开放释放线粒体死亡因子，激活线粒体凋亡途径促进细胞凋亡[9]。

2.3 JNK与TGF-β、非经典Wnt信号在机体纤维化中的作用 有研究[6]表明，Ras/TGF-β通过激活Wnt5a/PCP信号通路诱导细胞EMT发生，同时，Wnt5a作为TGF-β1的下游作用位点与Fzd6/Fzd8结合，在酪氨酸蛋白激酶7(PTK7)共受体和胶原三螺旋重复序列蛋白1(CTHRC1)的作用下，激活下游RhoA、Rac，促进JNK的表达并诱导NFATc1的活化和核转位，促进细胞迁移和侵袭，刺激肌成纤维细胞内Col、FN、VIM的表达，促进组织纤维化，沉默Wnt5a基因或抑制Wnt/JNK可阻止细胞迁移、逆转细胞EMT发生，阻断TGF-β对Wnt5a的诱导，降低Col和FN的表达，逆转纤维化[10-11]。TGF-β介导的Wnt5a/JNK1还可通过磷酸化Paxillin、促进基质金属蛋白-1、2(MMP1、2)、细胞间黏附分子(ICAM)和CD44的表达，上调VIM含量，降低E-cadherin的水平，促使上皮细胞发生EMT，促进细胞迁移[12]。不仅如此，Wnt-Fzd/ROR-Gα12/13-Rho/Lats1/2-YAP/TAZ-TEAD轴通过上调整合素αVβ6的表达,促进TGF-β1/Smad2/3的激活，促进细胞增殖、EMT及纤维化[13]。Wnt5a与Fzd结合，通过诱导Dvl2和c-Jun磷酸激活Wnt/JNK信号通路，同时诱导内源性Yes相关蛋白(YAP)去磷酸化和TAZ(具有 PDZ 结合基序的转录共激活因子)积聚。Wnt5a与Fzd1或ROR1-Fzd2/5共受体结合，在GPCR的Gα12/13作用下激活RhoA、Rac1,通过抑制肿瘤抑制基因-1/2(Lats1/2)激活YAP和TAZ，随后YAP/TAZ发生核转位及核积累，激活转录增强因子TEA结构域TEAD，上调下游靶基因Wnt5a、Wnt5b、Dickkopf1(Dkk1)、BMP4和胰岛素样生长因子-4(IGFBP4)的表达，从而调节细胞的增殖、迁移[13-14]。JNKs通过促进Lats1与其负调控因子LIM结构域包含蛋白-1(LIMD1)的结合抑制Lats的活性，激活YAP并促进其核转位、增加其转录活性，促进细胞增殖[15]。这些研究表明，Wnt/JNK与TGF-β信号通路相互作用，共同参与细胞纤维化的形成，也为其在眼部纤维化中的作用指出了方向。

3 JNK与TGF-β、非经典Wnt信号在眼部纤维化中的作用

3.1 角膜损伤修复

3.1.1 角膜基质的修复：创伤、手术、感染等损伤刺激激活多种细胞炎症因子并诱导角膜基质细胞EMT及纤维化的发生。瞬时受体电位(TRPA1)通过TGF-β1影响碱烧伤后角膜炎的炎性反应和瘢痕修复。在体外细胞实验中，TRPA1是MAPK信号通路被完全激活的必要条件。阻断TRPA1的激活伴TGF-β1、白细胞介素-6(IL-6)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达下调及JNK等MAPK蛋白激活的阻断，从而抑制角膜严重、持续的炎症和纤维化反应[16]。Shi等[17]在大鼠角膜穿通伤模型中发现，JNK是调节成纤维细胞内TGF-β1介导的结缔组织生长因子(CTGF)大量分泌的关键蛋白。结膜下注射SP600125抑制JNK可以有效抑制TGF-β1诱导的CTGF表达及成纤维细胞的增殖和细胞内FN、ColI的过度表达，从而阻断肌成纤维细胞的过度增殖和角膜瘢痕的形成。Jeon等[18]在猫角膜纤维母细胞中观察到过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)可以阻断TGF-β1诱导的CTGF水平升高，结合前人研究推测PPARγ配体可通过抑制JNK的激活阻断CTGF的上调或减少CTGF受体如低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP1)、甘露糖6-磷酸/胰岛素样生长因子-2受体(M6P/IGF-2-R)的合成，从而降低细胞对CTGF的敏感性。这些研究表明，TGF-β和JNK共同参与了角膜基质的瘢痕修复，抑制JNK或许可以抑制TGF-β对角膜纤维化的影响。然而，JNK抑制剂在角膜瘢痕的治疗中研究仍较少，未来仍需要进一步探索研究。

3.1.2 角膜上皮的修复：角膜上皮损伤后，多种炎症因子刺激一部分上皮细胞发生凋亡反应，另一部分则转分化为成纤维细胞，增殖并迁移到伤口部位参与损伤修复[19-20]。在体外细胞实验中发现，受损的角膜上皮细胞中，Wnt7a与Fzd9/10受体结合，通过Dvl2激活RacG12，激活c-Jun和AP-1，上调MMP12的表达，从而促进角膜上皮的增殖、迁移，促进角膜上皮的愈合。Saika等[21]则表明，TGF-β信号异常时，JNK信号通路的激活会抑制角膜上皮细胞的迁移、增殖，从而导致角膜愈合的延迟。在该实验中，敲除了Ⅱ型TGF-β受体(TBR-Ⅱ)的Tbr2ce△/ce△小鼠在创伤愈合早期，细胞内的JNK信号通路被激活，ATF-2与AP-1结合细胞周期停滞于G1/S期，细胞增殖被抑制。抑制JNK可以抑制ATF-2的磷酸化，解除细胞周期的阻滞，这与Lyu等[20]的研究结果似乎相反，故推测出现上述两个截然相反的结果原因如下：①与Saika等不同，Lyu等[20]所选取的实验对象为去除内皮层的人类供体的角巩膜缘供给的原代人类角膜上皮细胞(HCEC)，Wnt7a/JNK在活体实验中如何发挥作用仍有待进一步研究；同时，在不同组织、器官中通过不同Wnt配体或受体激活的JNK对细胞的迁移影响不同，Wnt5a、Wnt5b通过激活JNK上调MMP2、MMP9的表达，促进结直肠癌细胞COLO 205迁移[22]，Wnt11/Fzd7激活JNK促进HCT-116细胞迁移[23]，而Wnt7a/Fzd9通过激活JNK通路抑制非小细胞肺癌细胞的生长[24]，Wnt7a/JNK如何影响活体角膜上皮的损伤修复仍需进一步研究。②在角膜伤口愈合过程中TGF-β/Smad信号与MAPK信号通路常常共同作用，促进创伤愈合，Saika等[21]设计的动物模型中阻断了TGF-β信号通路，导致异常MAPK信号通路的激活，创伤愈合延迟。多种上游因子都可能触发JNK的激活，而Wnt蛋白是否在其中发挥作用，Wnt/JNK信号通路如何发挥作尚不明确。③角膜愈合是一个动态过程，不同信号通路此消彼长，多种通路协同作用共同完成受损组织的修复愈合。故而对JNK信号通路与Wnt、TGF-β间的相互作用机制的进一步探索研究要联系整体环境。尽管如此，JNK与TGF-β、Wnt信号通路在角膜上皮修复中的共同作用不可忽视，值得我们进一步探索。

3.2 青光眼中的纤维化 小梁网(TM)是房水流出途径的主要组成部分，TM纤维化可以导致房水流出阻力增加，眼压升高，促使青光眼的发生。Takahashi等[25]通过体外细胞实验发现，ECM-JNK-paxillin通路诱导细胞EMT发生，促进大量FN的表达，导致TM纤维化。使用SP600125抑制TM内ECM-JNK-paxillin通路，降低TM细胞对TGF-β2的敏感性，可有效抑制TM细胞中FN的表达及细胞EMT改变。传统的青光眼手术将房水通过人工引流途径排入结膜下从而降低眼压。TGF-β1通过非Smad依赖途径如，p38MAPK、JNK、ERK和PI3K/Akt通路上调miRNAs143和145的表达，诱导细胞EMT及结膜下纤维化。SP600125可以抑制人Tenon囊成纤维细胞(HTF)内TGF-β1对miRNAs143和145的诱导，抑制青光眼术后HTF的增殖及ECM收缩，抑制术后纤维化的发生[26]。由此可见，青光眼中的纤维化反应存在JNK和TGF-β的相互作用，JNK抑制剂或许可以成为延缓疾病发展、预防术后纤维化的药物之一。

3.3 白内障 白内障是世界性的致盲性疾病之一。JNK的激活可影响晶状体上皮细胞(LECs)的增殖[27]、迁移[28]、凋亡[29]和EMT[30]发生。抑制JNK活性，胚眼发育伴有明显的小眼症和晶状体缺损[28]。在TGF-β诱导的白内障中，非经典Wnt蛋白Wnt5a、受体Fzd2等有所上调[31]，提示非经典Wnt信号通路与TGF-β在促晶状体纤维化中存在相关性。有研究表明，穿心莲内酯(Andrographolide)，异名穿心莲乙素,分子式C20H30O5,可通过抑制LECs中pJNK的表达，抑制TGF-β2和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的α-SMA、FN、ColⅣ和VM的表达，从而抑制LECs EMT[30]。但只能侧面提示pJNK在TGF-β和bFGF诱导的白内障中发挥了一定的作用，JNK与TGF-β、Wnt信号通路如何在LECs纤维化中发挥作用，Wnt/JNK信号通路是否参与了TGF-β诱导的白内障的形成有待深入研究。在糖尿病性白内障中，TGF-β和成纤维细胞生长因子(FGF)的水平增加，同时细胞内质网应激使ROS、pERK1/2和pJNK1/2的水平上调，晶状体细胞生长和凋亡的平衡被破坏，两者共同促进了白内障的发生[32-33]。抑制醛糖还原酶(AR)可以显著抑制TGF-β和FGF诱导下LECs的增殖以及α-SMA、β-晶体蛋白(β-crystalin)和ICAM1的表达，同时也阻止了bFGF诱导的ERK1/2、JNK和NF-κB的激活[34]。这表明TGF-β/FGF参与下AR诱导的白内障形成中存在JNK的激活，抑制JNK或许能延缓糖尿病性白内障的发展。

3.4 视网膜纤维化疾病 年龄相关性黄斑变性(AMD)的终末期、增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)等都伴随着视觉细胞的损害及视网膜纤维化的发生，对患者视力造成严重的、不可逆的损伤。网膜前膜(ERM)和(或)视网膜下纤维膜(SRM)的形成是上述疾病的特征性表现，其关键病理机制是视网膜色素上皮(RPE)细胞EMT的发生[35]。L-肉碱(LC)(β-羟基-γ-N-三甲基丁酸铵)通过阻断Erk1/2和JNK信号通路，上调PPARγ的表达，抑制TGF-β1诱导的FN、α-SMA的表达，促进ECadherin的表达，从而抑制RPE的EMT[36]。维甲酸受体-γ(RAR-γ)激动剂R667可以抑制TGF-β2诱导的Smad2和Akt的激活及桩蛋白paxillin、ERK、p38和JNK磷酸化，抑制α-SMA、FN的表达，抑制RPE细胞EMT，抑制Col的表达，抑制SRM的形成[37]。TGF家族在RPE细胞EMT中发挥了至关重要的作用[38]，这些研究从侧面提示在TGF-β诱导的RPE细胞的EMT及纤维化过程中存在JNK信号通路的激活，同时也直接表明抑制JNK可有效抑制纤维化的发生，为视网膜纤维化疾病的治疗提供思路和实验室基础。

4 JNK信号通路与其他促纤维化因子在纤维化眼病中的作用

4.1 JNK信号通路与肝细胞生长因子(HGF) 在白内障中，HGF激活JNK/SAPK(p54和p46)，促进ATF-2和c-Jun的活化，上调细胞周期蛋白-1(Cyclin D1)的表达，刺激LECs进入S和G2/M周期，促进LECs的增殖。JNK抑制剂SP600125可显著抑制Cyclin D1的表达，抑制LECs的增殖[39]。

4.2 JNK信号通路与成纤维细胞生长因子(FGF) 在FGF作用下，LECs内Fzd、Dvl、Rho GTP酶、pJNK的表达增高，细胞骨架的结构发生改变，细胞的迁移力增强[40]。白花丹素(PLB)可以显著抑制FGF-2(10 ng/ml)诱导的JNK的磷酸化，抑制ARPE-19细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制MMP-2/9、Col Ⅰ、Col Ⅳ和Col Ⅵ的表达[41]。

4.3 JNK信号通路与表皮生长因子(EGF) EGF与JNK共同作用诱导的ARPE-19细胞增殖和迁移。Survivin抑制剂YM155通过上调pJNK，诱导ARPE-19细胞内吞表皮生长因子受体(EGFR),从而减弱了EGF诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移能力[42]。

4.4 JNK信号通路与血小板源性生长因子(PDGF) PDGF可以诱导PVR中RPE细胞的增殖和迁移效应。藏红花(Crocin)中富含的抗氧化剂藏红花酸类胡萝卜素(简称藏红花酸)通过诱导PI3K/Akt和ERK、p38、JNK的激活，诱导ARPE-19细胞的凋亡，同时抑制血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)的表达，抑制PDGF-Rβ诱导的ARPE-19细胞增殖和迁移[43]。这些研究都表明，JNK信号通路与多种促纤维因子共同作用直接或间接参与纤维化眼病的发生，为JNK信号通路在防治眼部纤维化疾病中的药理作用提供理论支持和研究思路。

5 结 语

在眼部纤维化疾病中，手术、外伤、炎症等刺激激活存储在房水和玻璃体中的细胞炎症因子，激活多种信号通路，促进纤维化眼病的发生。JNK蛋白既能被非经典Wnt蛋白激活，也能在TGF-β刺激下与多种细胞因子、炎症因子共同参与组织损伤修复。研究表明，抑制JNK可抑制细胞EMT，阻断肿瘤及纤维化疾病的发生。SP600125、AS602801和JNK-IN-8具有良好的抗癌前景且研究广泛；肽类抑制剂JNKi1通过干扰JIP1与MAPK的结合抑制JNK活性已被成功地用于小鼠肿瘤模型的治疗研究；异喹诺酮类衍生物AV-7、新型抑制肽PYC98、PYC71N、金刚烷基氮喹诺酮可选择性抑制JNK1的活性，被用于肿瘤治疗的研究；6-苯胺基吲唑类化合物、20-苯胺基-4、40-联吡啶类化合物、异恶唑类化合物、XG10291和吡啶酮类化合物对JNK3有选择性抑制作用，对神经退行性疾病的治疗有重要意义[44]。多种中医药物通过抑制JNK抑制细胞凋亡达到治疗目的[45]。藏红花素是一种名贵中药材，具有抗氧化、抗炎的作用[46]。藏红花可通过下调视网膜中p38、JNK、NF-κB和c-Jun的磷酸化水平,阻断Caspase 3蛋白的表达，抑制视网膜神经节细胞(RGCs)的凋亡，减轻神经节细胞轴突损伤[47-48]。然而对JNK抑制剂的临床应用仍缺乏更多的证据。因此，了解JNK信号通路在眼病纤维化疾病的发病机制中的作用，或许可以为纤维化眼病的药物治疗打开新思路。