金雀异黄素微粒多糖载体研究进展

江琼芳，应 浩，钱婉婷，江 林，柳张葳，李曼莉

（桂林旅游学院，广西桂林 541006）

0 引言

金雀异黄素（Genistein，缩写为Gen） 又名染料木黄酮，化学名为4′,5,7 - 三羟基异黄酮，是从豆科植物中提取的一种天然异黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、类雌激素、免疫调节等多种生物活性[1]。因具有苦味、水溶性差、生物利用度低等缺陷，限制了其在食品和医药领域中的应用[2]。为改善其生物活性，扩大其应用范围，利用合适的载体包封和输送金雀异黄素已成为当前研究的热点。

现有研究显示，脂类、蛋白质、糖类等材料均可当作载体制备微米级、纳米级的Gen 微粒，从而提高Gen 的水溶性和生物利用度，进而改善其活性效应[3]。以多糖为载体的Gen 微粒因具有较高生物相容性、生物可降解性和可再生性等特点，使其成为非常具有吸引力的Gen 包封和递送载体。常用的Gen 微粒多糖载体有壳聚糖（CS） 及其衍生物、环糊精（CDs） 及其衍生物、淀粉、葡聚糖等。依据制备Gen 微粒所用多糖载体材料的不同，对Gen 微粒多糖载体的制备方法、特点及其对Gen 生物活性的影响进行了综述，并对Gen 微粒多糖载体的发展进行了展望。

1 壳聚糖及其衍生物载体

壳聚糖（CS） 及其衍生物是一类具有亲水性、生物相容性和无毒性的天然高分子材料，被广泛应用于Gen 等食品功能因子与药物的输送、组织工程和伤口愈合等方面[4]。利用壳聚糖及其衍生物为载体包封Gen 的方法主要有交联法、离子诱导法和自组装法等[5]，包封后可显著提高微粒中Gen 的水溶性、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等活性，制成微粒尤其是纳米化的Gen 微粒后还可使其中的Gen 在磷酸盐缓冲液（PBS）、模拟胃肠液和动物血液等介质中呈现良好的缓、控释性能。

吴婉莹等人[6]制备了微球口服胶囊制剂Gen-CS。微球胶囊中Gen 在小鼠体内各脏器的浓度与普通胶囊相比降低较缓慢，可在较长时间内使Gen 维持一定的浓度。普通胶囊Gen 在小鼠体内分布以肝脏为主，微球胶囊Gen 以肺与脾脏为主，而在肝脏与肾脏的分布均减少。冯淑莹等人[7]以CS 为载体，戊二醛为交联剂，采用乳化分散- 化学交联法，制备了球形规整、平均粒径2～4 μm 的微球Gen-CS。在CS和Gen 质量比为4∶1，CS 质量分数为1%，反应介质pH 值为11 的条件下微球载药量为10.5%，包封率达52.5%，成球后药物结晶度降低。体外累积释放率纯Gen 在5 h 可达45%，而微球在15 h 才释放10%。同时，微球中Gen 释放率受载体质量分数、交联时pH 值和释放介质pH 值的影响。王莹等人[5]采用离子诱导法制备了粒径为200～300 nm，包封率为37.1%，载药量为9.3%的球形纳米粒Gen-CS。Gen 的结构和性质并没有因为制成纳米粒而发生变化。陈圆等人[8]进一步研究显示，该纳米粒的体外释放与介质pH 值和离子浓度有关。纯Gen 在介质中呈线性释放；纳米粒子在释放介质中先快速释药，后缓慢释放。Ibrahim S 等人[9]采用静电纺丝法以3∶7（V∶V） 的CS 和聚乙烯醇制备了粒径为60.51 nm 的纳米纤维Gen-CS-PVA。纳米纤维在体外（PBS） 具控释效应，对人成纤维细胞（W138） 无毒；在体内可使脊髓受损雌性SD 大鼠脊髓组织中抗氧化酶活性增强，抗炎性细胞因子水平升高，而使促炎性细胞因子浓度下降，Gen-CS-PVA 纳米纤维明显提高了脊髓受损大鼠脊髓组织的抗氧化和抗炎症能力[4]，为神经组织炎症性疾病的治疗提供了新的思路。Rahmani F 等人[10]以物质的量比为4∶1 的CS 和三聚磷酸钠为原料，采用超声搅拌的方法制备了粒径为（788±3.45） nm，多分散指数为0.29，包封率达（76.8±14.69） %，呈球形的纳米粒CHI-En/Gen。该纳米粒对正常人皮肤成纤维细胞的活力无影响，却能显著抑制人结肠癌HT-29 细胞的生长和增殖，可使HT-29 细胞发生凋亡性死亡。鸡胚绒毛尿囊膜试验显示该纳米粒还具有抗血管生成活性。

Vanden Brabera N L 等人[11-12]以美拉德反应制备的水溶性CS 衍生物（WSCh） 为载体包埋Gen，得到粒径约为2.62 μm，包埋率为（78±5） %的微囊化MCGe。微囊中Gen 在体外模拟胃肠液条件下呈两相释放模式，体外抗氧化能力显著高于纯Gen。葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎雌性小鼠连续10 d 饲喂MCGe（0.08 mg/d），可显著减轻小鼠结肠炎的症状。微囊化Gen 有望成为治疗氧化性炎症疾病的新选择。

随着研究的不断深入，以壳聚糖为载体的Gen微粒通过与磁性材料、特定靶向配体等的结合，可提高Gen 在靶部位的聚集，进而增强其对靶部位的活性效应。目前，对这类靶向性Gen 微粒多糖载体的研究总体还较少。张龙等人[13]以CS、Fe3O4为主要原料，采用离子诱导法在优化的条件下制备了具有磁性的Gen 靶向CS 纳米粒子。微球粒径在300～800 nm，具有良好的磁响应性和体外缓释性。Cai L等人[14]以叶酸（FA）、CS、Gen 为原料，制备了粒径约为165 nm 的球形纳米粒FGCN（含FA） 及GCN（不含FA）。2 种纳米粒体外释放曲线相似，对Gen有良好的控释效应。FGCN 对人宫颈癌HeLa 细胞的抑制能力和诱导凋亡能力要显著强于GCN 和游离Gen。因叶酸与HeLa 细胞中大量存在的叶酸受体- α具有高度亲和力，致使FGCN 与细胞间通过配体- 受体的特异结合，显著提高了对HeLa 细胞的靶向性。

2 环糊精及其衍生物载体

环糊精（CDs） 是含有6 个单位α - 环糊精（α-CD）、7 个单位β- 环糊精（β-CD） 和8 个单位γ-环糊精（γ-CD） 并用α（1-4） 糖苷键连接的环状寡糖。在各种CDs 中，β-CD 是更为常用的提高Gen 等食品功能因子与药物水溶性的CDs。β-CD 分子的外部亲水，内部亲脂，其锥形排列有助于其在不经过任何化学修饰的情况下，通过非共价键的方式包封亲脂分子，从而提高亲脂分子的水溶性、稳定性和生物利用度[15-16]。利用环糊精及其衍生物为载体包封Gen 的方法主要有酸碱中和法、溶剂蒸发法、湿揉制法和纯研磨法等。经上述方法有效包合后可显著提高微粒中Gen 在水中的溶解度和溶出度、跨膜通透性、抗氧化和抗肿瘤等活性。

雷英杰等人[15]以β-CD 为载体，采用改良的酸碱中和法在Gen 和β-CD 物质的量比为1∶1 时制备了包封率大于90%的包合物Gen-β-CD。该研究显示，在β-CD 和Gen 的包合过程中出现了一种新的物相，即形成了Gen-β-CD 包合物。在饱和水溶液中，Genβ-CD 中Gen 含量（30 μg/mL） 为纯Gen（2 μg/mL）的15 倍，即制成包合物后显著提高了Gen 在水中的溶解度。Zafar A 等人[16]以1∶1∶0.05（W/W） 的Gen、β-CD 和TPGS 为原料，采用溶剂蒸发法制备了含Gen 的三元包合物GTTIC2。包合后结晶Gen 转变为非晶态。包合物显示出增强的稳定常数和络合效率，饱和溶解度包合物约为纯Gen 的48.09 倍；体外模拟释放率包合物为纯Gen 的5.9 倍。在100 μg/mL质量浓度下，包合物的DPPH 自由基清除率为纯Gen的1.17 倍。对人乳腺癌MCF-7 细胞的半数抑制浓度包合物只有纯Gen 的60.15 %。即Gen 与β-CDs 和TPGS 的有效包合显著增加了Gen 的溶解度、溶出度和体外抗氧化和抗肿瘤活性。该三元包合物的制备为提高以Gen 为代表的低可溶性药物口服递送效果提供了新的途径。

Daruházi Á E 等人[17]以不同的环糊精β-CD、γ-CD 及其衍生物2- 羟丙基-β-CD（HP-β-CD） 和随机甲基-β-CD（RAMEβ-CD） 为载体，采用湿揉制的方法制备了呈固态、分子分散的Gen 环糊精及其衍生物包合物。相对纯Gen，包合物显著提高了Gen水溶性，且环糊精衍生物所形成包合物（Gen/HPβ-CD 和Gen/RAMEβ-CD） 的溶解度要高于环糊精所形成的包合物（Gen/β-CD 和Gen/γ-CD）。人结肠癌Caco-2 单层细胞通透性试验显示表观渗透系数和跨膜Gen 量，包合物均显著高于纯Gen，即Gen 与环糊精及其衍生物形成包合物后显著地改善了Gen 膜渗透作用。Fumi C 等人[18]分别以HP-β-CD 和磺丁基- β - 环糊精钠盐（SBE- β-CD） 为载体，采用纯研磨的方法制备了环糊精包封的Gen 固态复合物Gen/HP-β-CD 和Gen/SBE- β-CD，共同研磨形成复合物后显著增强了Gen 的溶解度。3～6 μg/mL 处理72 h，纯Gen 及其共研磨环糊精复合物降低了来自黏多糖贮积症（MPS） 2 型和3 型患者成纤维细胞糖胺聚糖合成能力，且呈剂量依赖性；对正常成纤维细胞的增殖能力和乳酸脱氢酶活性没有显著影响。Gen 共研磨环糊精复合物可以作为遗传性糖胺聚糖代谢异常疾病MPS 联合治疗的一部分。这种纯研磨无溶剂、清洁的绿色化学Gen 微粒制备方法具有良好的发展前景。

3 其他多糖载体

除壳聚糖及其衍生物、环糊精及其衍生物可充当Gen 微粒的多糖载体外，淀粉、凝胶多糖、葡聚糖等亦可作为Gen 的微粒载体。因多糖结构上的差异性，致使他们在和Gen 包封时所采用的方法各不相同。这些多糖载体多被用作提高Gen 在水中的溶解度，保护Gen 在模拟消化道环境中的稳定性和控制Gen 在模拟介质中的释放速率。

Cohen R 等人[19]以土豆直链淀粉（A） 和含直链淀粉高的玉米淀粉（HACS） 为原料，采用酸化碱溶液的方法与Gen 一起制备了粒径为微米级的淀粉复合物Gen-A 和Gen-HACS。Gen-A 中Gen 含量显著高于Gen-HACS。体外释放研究显示，2 种复合体在pH 值3～8 的范围内稳定；在pH 值6.9 的PBS 中，复合体在30 ℃和50 ℃下稳定，而在80 ℃时稳定性较低。2 种复合物在模拟胃液条件下均表现出较高的Gen 滞留量；在胰酶溶液中的Gen 释放量分别是PBS 溶液中的4.92 倍和2.32 倍。即淀粉包封后减少了Gen 在酸性胃环境中的降解，而却能在胰酶溶液消化后释放Gen。该方法制备的Gen 淀粉复合物可在模拟介质中控制Gen 的释放。Soleimanpour M 等人[20]以玉米淀粉为原料，制备了平均粒径为105.4 nm的介孔淀粉。介孔淀粉与Gen 以1∶1（W/W） 包埋后，Gen 包封率达79.9 %，纳米粒中Gen 在模拟胃肠道消化液溶出率要显著高于游离Gen 粉末，释放曲线呈典型的两相释放模式。

Lakshminarayanan R 等人[2]以凝胶多糖Curdlan 为载体，用4 种不同的方法制备了4 种微米级的Gen-Curdlan（GC） 复合物I～IV。在4 种复合物种，Gen的总量（mg/100 mg 干物质） 复合物I（2.3） 显著高于其他复合物II（1.8）、III（1.0） 和IV（1.8）。复合物改变了纯组分的结晶性质，Curdlan 和Gen 之间存在分子间相互作用。4 种GC 复合物中Gen 的释放时间均可延长至72 h，且其中Gen 的释放量在加入溶壁酶（Lyticase） 的模拟肠液中均高于在PBS（pH值6.9） 中的释放量，而Curdlan 可在溶壁酶的作用下降解。即在裂解酶对Curdlan 的酶解作用下，GC复合物中Gen 的释放增强。通过酶促降解载体而调节Gen 释放的新型药物缓释系统为Gen 微粒体在食品和药品领域的开发应用提供了一种新的策略。Semyonov D 等人[21]以蔗糖为底物，用葡聚糖蔗糖酶酶促合成了葡聚糖球形纳米粒，进而包封形成葡聚糖包结的Gen 纳米粒，其中Gen 含量可达5.6 g Gen/100 g纳米粒。利用酶促合成Gen 微粒多糖载体的方法为利用葡聚糖的溶解性提高Gen 的溶解度和生物利用度提供了新途径。Jangid A K 等人[22]以多糖菊粉、硬脂酸为原料，运用薄膜水化法制备了载Gen、粒径为115 nm，包封率达92.2 %的纳米粒GNP。GNP 中Gen 在模拟胃肠液中的释放具有位点特异性（胃中少，肠中多） 和明显的缓、控释效应。处理人结直肠癌HCT 116 细胞48 h，GNP 的半数抑制浓度显著低于纯Gen 悬液。

4 结语

综上所述，Gen 微粒多糖载体中研究相对较多的为壳聚糖（CS） 及其衍生物、环糊精（CDs） 及其衍生物，而对以淀粉、葡聚糖和凝胶多糖等为载体的Gen 微粒的研究则相对较少。多糖载体用于制备Gen 微粒的方法因所用多糖种类的不同而异。壳聚糖及其衍生物包封Gen 的方法主要有交联法、离子诱导法和自组装法等，也有用静电纺丝和超声搅拌等方法。环糊精及其衍生物包封Gen 的方法主要有酸碱中和法、溶剂蒸发法、湿揉制法和纯研磨法等。

因淀粉、环糊精及其衍生物本身结构的特殊性，通常以他们为载体的Gen 微粒的粒径较大，多在微米级以上，而以壳聚糖、葡聚糖、菊粉等多糖为载体制备的Gen 微粒粒径多为纳米级的。多糖载体在与Gen 形成共包封物后，微粒中Gen 通常由结晶态向非晶态转变，增加了Gen 在水中的溶解度和溶出速率，改善了微粒中Gen 在PBS、模拟胃肠液、血液等介质中的释放行为。同时，多糖包合物还能减轻胃刺激，增强Gen 在胃肠道内的稳定性，提高Gen 在体内的生物利用度，并掩盖Gen 的苦味。

当前，以多糖为载体的Gen 微粒在改善Gen 性能方面的研究主要集中在多糖包合物中Gen 在体外介质（如模拟胃肠液、PBS 等） 中的溶解度、溶出度和释放机制等，而对Gen 多糖包合物在血液和动物体内的释放行为研究则较少。在改善Gen 生物活性效应方面的研究主要集中在体外抗肿瘤和动物体内抗炎症方面：①抗肿瘤：多糖包合物在体外显示出对人结肠癌HT-29 细胞、人乳腺癌MCF-7 细胞、人结直肠癌HCT 116 细胞、人宫颈癌HeLa 细胞等显著的抑制作用，其抗肿瘤的机制主要是抑制肿瘤细胞增殖、诱使细胞凋亡和抗新生血管生成等。②抗炎：对小鼠体内结肠炎和大鼠因脊髓受损所引起的神经组织炎症性疾病显示出良好的治疗作用，其抗炎症的主要作用机制是促使体内抗氧化酶活性增强、抗炎性细胞因子水平升高、促炎性细胞因子水平下降等。此外，以多糖为载体的Gen 微粒还有体外抑制黏多糖贮积症（MPS） 2 型和3 型患者成纤维细胞糖胺聚糖合成能力等生物活性效应。目前，对以多糖为载体的Gen 微粒在动物体内的药代动力学、生物利用度、抗肿瘤及其机制等方面的研究还较少。

未来除了要加强以多糖为载体的Gen 微粒在动物体内和临床前试验研究外，制备纳米化和具有靶向性的Gen 多糖包合物将是多糖载体包封Gen 极具前途的发展方向。纳米化在缩小Gen 微粒体积的同时增加了药物与细胞、组织的接触面积，利于提高药物的浓度；通过与Fe3O4等具有磁性的物质结合和加入叶酸等配体物质，可增强Gen 微粒在靶器官、靶组织的聚集，使药物的靶向性增强，利于精准化给药，充分发挥Gen 的生物活性。大部分Gen 微粒多糖载体具有生物可降解、无毒的性质，而且易于制备、重现性好和价格低廉，可与Gen 等疏水性物质形成包合物。因此，以多糖为载体的Gen 微粒在食品和医药领域极具发展前景。