碳点增敏的流动注射化学发光法测定食品中二氧化硫的含量

曹烁，曾鸿林，周佳欣，邵思远，刘丰睿，陈浩然，陈芳

华中科技大学化学与化工学院，武汉 430074

二氧化硫是最常见的一种硫氧化物。在食品工业中，二氧化硫可作为食品添加剂发挥防腐、漂白、护色和抗氧化的作用。我国的国家标准对食品工业中二氧化硫的使用限量及残留量有明确规定[1]。建立和完善相应的分析检测方法以保证二氧化硫在食品生产中的合理使用，有利于为食品卫生和安全提供技术保障。测定食品中的二氧化硫的含量，国标推荐的碘量法滴定是最常用的方法[2]。用碘标准溶液滴定酸化处理后的样品，根据所消耗的碘标准溶液量计算出样品中的二氧化硫含量。

碳点(Carbon dots，CDs)是一种准球形的碳纳米材料，21世纪初由美国克莱蒙森大学的科学家首次研制。它是一种与半导体量子点具有相似光学性能的环境友好型荧光纳米材料，具有细胞毒性低、生物相容性好、制备成本低廉、易于功能化修饰和反应条件温和等优势，在生物标记与细胞成像、光催化剂等领域均有应用[3,4]。研究表明，碳点可以增敏一些体系的化学发光，如增敏鲁米诺-过氧化氢体系以检测葡萄糖[5]或雷尼替丁[6]，增敏鲁米诺-高锰酸钾体系用于检测异萘酚[7]，以及增敏亚硫酸氢钠-重铬酸钾体系测碘化物[8]含量等。

化学发光分析是一种基于化学发光反应，依据反应产生的发光强度或者总发光量进行分析检测的方法。酸性高锰酸钾氧化亚硫酸根时可以产生微弱化学发光，直接用于二氧化硫含量测定时灵敏度很低。通常可以加入有机荧光分子[9-11]、稀土配合物等[12,13]、纳米材料[14,15]等作为增敏剂提高灵敏度。本文基于碳点可以敏化酸性KMnO4-Na2SO3体系的化学发光，结合流动注射技术建立了食品中亚硫酸盐测定的方法。该实验目前已作为我校本科生创新实验内容，在让学生掌握化学发光、流动注射等分析技术的同时，学习科学研究的基本方法，提高思考能力。

1 实验原理

1.1 酸性KMnO4-SO32-体系化学发光及碳点增敏原理

酸性高锰酸钾氧化亚硫酸根可产生化学发光[16]。此反应最初被用于二氧化硫和亚硫酸根的测定，还可以建立大气环境中微量二氧化硫的高灵敏度检测方法[17]。发光机理：发光体为激发态的二氧化硫，其发射波长位于450-600 nm，反应式如下：

该发光体系的量子产率低，发光强度弱，直接用于亚硫酸盐检测灵敏度很低。碳点加入后可作为催化剂有效加快体系中中间体或激发态物质的生成速度，也能作为能量受体接受激发态中间体的部分或全部能量，或者直接作为发光体，大大增强化学发光。

1.2 流动注射法

流动注射分析，由Hansen和Ruzicka在1975年首次提出，是一种新型的定量流动分析技术[18]。它可以在非平衡的状态下，在液流中重现地处理样品，并进行准确的测定。蠕动泵通过一定的速度将试样和载流泵入管路，以六通阀给待测试剂定量，两者在反应器中混合同时发生反应，检测器检测到响应信号后，通过输出装置输出信号。

在样品通过分析流路时，以完全相同的方法顺序处理所有的样品，检测器所记录的是连续变化的信号(如：吸光度、电极电势)，因而不需要达到化学平衡(稳态条件)。其中，准确样品体积的注入、精确重现的定时进样，以及从注入点到位测点体系完全相同的操作(即控制或可控分散)，形成注入样品的浓度梯度，从而产生瞬间的、但可精确重现的记录信号，使得流路中的任何一点都能像稳态一样准确测量。

2 仪器与试剂

仪器：流动注射化学发光仪(西安瑞迈PM-B)、静态化学发光分析仪(本实验室自组装化学发光暗箱，其中发光强度用R105型光电倍增管(购自北京滨松电子有限公司)检测，实验信号采集用N2000型色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)、水热反应釜、烘箱。

试剂与材料：柠檬酸、乙二胺、高锰酸钾、亚硫酸钠、氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司，AR)、透析袋(截留分子量为1000 Da)、食品样品(葡萄干、红枣、燕麦片)。

3 实验内容

3.1 碳点的制备

碳点的制备方法参考文献[19,20]，具体方法如下：在烧杯中加入1.0 g柠檬酸、2.0 mL水和300 μL乙二胺混合后转移至内胆为聚四氟乙烯的水热反应釜中，165 °C的反应2.5 h。稀释后转移至截留分子量为1000 Da的透析袋中，透析48 h。透析后得到淡黄色透明溶液，置于4 °C冰箱中保存备用。

3.2 静态化学发光测试

静态化学发光测试采用实验室自制化学发光检测器。在反应容器中加入1.00 mL 0.02 mmol·L-1的亚硫酸钠溶液、1.00 mL 0.0204 mg·mL-1的碳点溶液并混合均匀，通过注射器注入1.00 mL的0.10 mmol·L-1的高锰酸钾溶液，记录发光强度与时间的关系得到化学发光动力学曲线。

3.3 流动注射分析测试及条件优化实验

流动注射化学测试仪器结构如图1所示，A泵驱动载留水与高锰酸钾溶液经六通阀后交替流动到管路中，B泵驱动的亚硫酸钠和碳点溶液混合，上述两个溶液混合后流经底部安装有光电倍增管的检测池。光电倍增管将发光信号转换为电信号，由电脑记录下发光强度随时间的变化曲线。

图1 流动注射仪结构以及进样示意图

3.3.1 仪器参数的优化实验

实验中选择对采样速率、放大级数、光电倍增管的电压、泵速与阀速这几个仪器参数进行优化。通过改变上述仪器参数的其中一个，固定其他参数，测试参数对发光信号的精细度、峰展宽、峰高以及峰面积的影响。

3.3.2 试剂适宜浓度的探索实验

实验中采用的高锰酸钾溶液的浓度、酸的种类和碳点的浓度都会对最后的测定结果产生影响，故需测试上述条件对发光强度的影响。测试时将其他浓度固定不变，改变其中试剂浓度进行测试。

3.4 样品的前处理方法及测定

本次实验测定的样品是葡萄干、红枣和燕麦片。将烘干的葡萄干、红枣和燕麦片分别用料理机粉碎，准确称取10.00 g粉碎后的样品，加入30.0 mL 0.10 mol·L-1的NaOH混匀，超声提取15 min后用高速离心机8000 r·min-1离心10 min，取上清液定容至50 mL，4 °C保存。为保证样品分析结果的准确性，在定容之前不能有样品损失。如果上清液不能完全转移，可再加入水混合均匀并离心后再次转移。分析时根据发光峰面积定量。

4 实验结果及讨论

4.1 化学发光动力学曲线

采用静态化学发光仪测定体系在没有增敏剂和加入碳点作为增敏剂时的发光动力学曲线，结果如图2所示。在没有增敏剂时，体系的化学发光很弱；加入碳点作为增敏剂后，体系的发光强度急剧增加。

图2 有无碳点增敏条件下的化学发光动力学曲线

4.2 仪器参数对化学发光的影响

实验中应选取恰当的采样速率、放大级数、光电倍增管高压、泵速和阀速。下面针对重要的进行说明。

4.2.1 光电倍增管电压的影响

如图3a所示，光电倍增管的电压会影响峰高和基线信噪比。电压过小，会导致发光峰很小；电压过大则会导致基线噪音增加。本实验选用900 V为最佳电压。

4.2.2 泵速的影响

泵速是指蠕动泵每分钟的转速，会影响管路中液体的流动速度。如图3b所示，测定同一个样品时，采用不同的泵速，峰面积基本不变，而泵速会影响峰的展宽。理论上泵速越快峰的宽度越小，就越容易分辨。

根据化学发光动力学曲线(图2)，本实验的化学发光反应速度很快，因此较快的泵速将有利于两个泵驱动的溶液混合后能尽快到达检测器上方，化学发光信号增加。实验结果如图3b所示，化学发光信号增加泵速增加。但过快的泵速会导致仪器振动，因此本实验选用的泵速为40r·min-1。

图3 (a)光电倍增管电压对发光信号的影响；(b)蠕动泵转速对发光信号的影响

4.3 反应物浓度对发光的影响

4.3.1 碳点的浓度的影响

考察了碳点的浓度对发光强度的影响，结果如图4a所示。没有碳点时体系发光强度很小，随着碳点浓度增加，发光强度逐渐增加。碳点浓度太大时，可能会发生猝灭作用，发光强度逐步降低。因此选择发光强度最大的碳点浓度2.04 × 10-5mg·L-1开展后续实验。

图4 (a) 0.10 mmol·L-1的高锰酸钾和0.10 mmol·L-1的亚硫酸钠条件下碳点浓度对发光强度的影响；(b) 2.04 × 10-5 mg·L-1的碳点和0.10 mmol·L-1的亚硫酸钠条件下高锰酸钾浓度对发光强度的影响；(c)不同酸介质下的检测信号

4.3.2 高锰酸钾浓度及其酸度的影响

高锰酸钾是该化学发光体系的氧化剂，因此没有高锰酸钾时体系没有化学发光，随着高锰酸钾的浓度增加，体系发光强度急剧上升(图4b)。当高锰酸钾浓度大于0.10 mmol·L-1时，由于高锰酸钾可能会吸收光，增加其浓度发光强度逐渐下降。因此，本实验选用的高锰酸钾的最佳浓度是0.10 mmol·L-1。酸介质会影响高锰酸钾的氧化性，因此考察了不同种类的酸对体系化学发光的影响以及不额外加酸的情况对峰的影响(图4c)。结果表明采用pH为1.55的H2SO4介质时发光峰面积大且峰形规整，所以用的0.081 mol·L-1的硫酸作为实验优化后的条件。

4.4 方法的分析性能及样品测定

4.4.1 方法的分析性能

图5a和b分别是优化实验条件下，不同亚硫酸钠浓度的发光信号及亚硫酸钠测定的标准曲线。发光强度与亚硫酸钠的浓度在1.0 × 10-5-2.5 × 10-4mol·L-1范围内呈线性关系，线性方程为I = 218 +39.8 × 106c (mol·L-1)，检出限为7.79 × 10-6mol·L-1。对浓度为3.0 × 10-5mol·L-1的亚硫酸钠平行测定5次，RSD为3.8%。

4.4.2 样品中二氧化硫的测定

实验采用外标法进行定量测定，实验结果如表1所示。葡萄干、红枣、燕麦片中的二氧化硫含量分别为34.78、38.9和41.4 mg·kg-1，均符合国家标准[1]。采用加标回收法验证分析方法的准确性，结果如表1所示，加标回收率在86.2%-101.3%之间。

图5 (a)亚硫酸钠测定的标准曲线；(b)不同浓度亚硫酸钠的化学发光强度图

表1 样品亚硫酸盐测定结果及回收率

4.5 碳点增敏机理讨论

根据文献[16,21,22]可知，酸性Na2SO3-KMnO4体系中发光体是激发态二氧化硫SO2*。另有文献报道高锰酸钾可氧化CdS量子点，发出量子点在520 nm的荧光[23]。此外，有文献研究发现氧化剂存在的条件下，碳点很容易被氧化剂注入空穴或电子，成为发光体[24]。在结合相关文献推测[25]，本实验的NCDs-Na2SO3-KMnO4体系中发光体有两个：SO2*和激发态的氧化碳点，NCDs在该发光体系中有催化剂和发光体双重身份。

5 思考题

(1)为什么蠕动泵的转速会影响流动注射化学发光的强度？流动注射化学发光检测到的信号与静态注射化学发光的检测信号有何不同？

(2)同为发光分析方法，与荧光分析方法相比，化学发光分析有何特点？仪器构造有什么不同？

(3)为保证样品分析结果的准确性，在样品前处理过程中需要注意什么？在样品全部转移至容量瓶中定容之后需要注意什么？

(4)本实验中采用什么方法验证分析方法的准确性？还有哪些方法常用于验证分析方法的准确性？

6 实验特点及教学组织运行方式

6.1 教学组织运行方式

本实验属于仪器分析综合实验，涉及到仪器分析课程中的化学发光分析法、流动注射进样技术和纳米材料的制备，适合在化学类专业高年级开设。建议分4个环节开展实验：1)课外预习，自主学习流动注射技术，设计实验方案；2)实验方案讨论，确定方法建立实验验证、仪器参数设置、试剂浓度确定等具体内容；3)实验操作环节，期间需要根据实验情况调整实验方案，根据实验内容本环节可以设置为8-24个学时；4)完成实验报告及成果汇报PPT，分享实验结果和经验，教师点评总结，知识巩固。

6.2 实验特点

本实验主要让学生学习了化学发光分析方法，掌握流动注射进样技术。通过仪器参数的优化，学习化学发光的特性、仪器构造、流动注射装置、光电倍增管的响应特点等；通过实验条件的优化，理解化学发光的原理及其影响因素；通过样品测定，学习常规的样品前处理技术；通过加标回收实验，学习分析方法准确性的验证。学生基于本实验申请到了我校的大学生创新研究项目。

7 结语

实验采用酸性高锰酸钾-亚硫酸盐化学发光体系，以廉价环保的碳量子点为增敏剂，建立了一种流动注射化学发光的分析方法用于葡萄干、红枣、燕麦片等食品中二氧化硫含量的测定。通过该实验可帮助学生掌握在同类高校中开设较少的化学发光、流动注射等分析技术的原理及应用，深入理解化学发光的原理和特性，学习样品前处理技术和分析方法准确性的验证方法。