基于数据挖掘和网络药理学探讨中医药治疗骨质疏松症的用药规律及机制Δ

段小云，仲瑞雪，吴传红，季 欧(四川省骨科医院药学部，成都 610041)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)属于骨代谢性疾病，可导致骨量降低及骨组织微结构破坏[1-2]。该病与年龄增长紧密相关，随着我国老龄人口不断增加，OP已成为我国面临的严峻挑战之一[3]。中医学中并未收载“骨质疏松症”的病名，根据OP的病理机制及临床表现，将其归属为中医“骨痿”范畴[4]。因“肾主身之骨髓”，其病变在骨，但其本在肾，又因OP多由肝肾亏虚的“虚”所致，目前临床上中医药治疗OP多以补肾壮骨类药物为主，中医药防治OP具有临床疗效好、不良反应小等优势，具有广泛的应用前景[5-6]。本研究对中国知网(CNKI)中收录的中医药治疗OP的方剂进行检索及梳理，挖掘中医药用药规律，并进行网络药理学分析。

1 资料与方法

1.1 处方来源与筛选

以“中药”“中医”“骨质疏松”和“骨痿”等为检索词，在CNKI中进行检索，时间设定为2015—2022年，参照《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识(第三稿·2014版)》[7]和《内科学》(第2版)[8]中的诊断标准，剔除异名同药方剂及外用药方，筛选出药味、剂量完整的有效处方104张。

1.2 分析平台

采用“中医传承辅助平台(V2.5)”，由中国中医科学院中药研究所研发。

1.3 药物命名

根据《中华人民共和国药典》(2020年版)，对104张有效处方中药物名称进行梳理、规范。如将“破故纸”规范为“补骨脂”，“仙灵脾”改为“淫羊藿”等，双人核对录入。

1.4 数据统计

运用软件的“数据分析”选项下“频次统计”“组方规律”及“新方分析”等不同功能，挖掘处方中的用药规律，如使用频次、关联规则及新方组合等。

1.5 网络药理学分析

运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选有效成分及靶点，与从GeneCards等数据库中筛选出OP的靶点相交，获得治疗OP的潜在靶点。将上述靶点导入STRING数据库中，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。

2 结果

2.1 药物使用频次分析

104张有效处方中共涉及135味中药，使用总频次为1 164次，进行药物使用频次分析。结果显示，使用频次≥30次的药物有69味，排序居前3位的药物分别为熟地黄、淫羊藿和当归，见表1。

表1 104张处方中使用频次≥30次的药物Tab 1 Drugs with application frequency ≥ 30 times in 104 prescriptions

2.2 药物的归经分布

治疗OP常用药物多归肝、肾及脾经，见表2。

表2 104张处方中药物归经分析Tab 2 Analysis of meridian tropism in 104 prescriptions

2.3 组方规律

对数据实施预处理后，将支持度设定为30，置信度个数设定为0.70[9-10]，得到常见的药物组合。其中“熟地黄→淫羊藿”“熟地黄→当归”及“淫羊藿→补骨脂”居前3位，见表3—4。通过网络化展示其关联规律，其中熟地黄、淫羊藿等居于网络图中心位置，与常用药物组合吻合，见图1。

表3 104张处方中的药物组合Tab 3 Medicine flavor combination in 104 prescriptions

表4 104张处方中药物组合关联规则(置信度≥0.70)Tab 4 Medicine flavor combination association rule in 104 prescriptions (confidence≥0.70)

图1 关联规则网络化展示(支持度≥28.85% ，置信度≥0.70)Fig 1 Network display of association rules (support ≥28.85%, confidence ≥0.70)

2.4 常用组合分析

设相关度=7，惩罚度=2，基于复杂系统熵的聚类分析[9-10]，得到药物的常用组合，见表5。

表5 基于复杂系统熵聚类分析的常用组合Tab 5 Complex systems common combinations based on entropy cluster

2.5 新方分析

通过核心药物组合，进行新方药物组合分析，选择“聚类”项下提取新方组合，共推荐18个可供选择的新方药物组合，进一步选择“聚类”选项，筛选后得到推荐的9个新方，见表6—7；并得出新方组合的网络关联图，见图2。

图2 中医治疗OP的新方组合Fig 2 New prescription combination of traditional Chinese medicine in the treatment of OP

表6 新方聚类的核心组合分布Tab 6 Core combination distribution of new square clustering

表7 基于熵层次聚类的潜在新方组合Tab 7 Potential new party combination based on entropy hierarchical clustering

2.6 网络药理学机制研究

2.6.1 药物活性成分及作用靶点的筛选：通过TCMSP数据库检索熟地黄、淫羊藿、当归、牛膝及黄芪的化合物成分(设置OB≥30%，DL≥0.18)及靶点预测，再经Uniprot数据校正，去掉非人类靶点。经汇总删重后，获得熟地黄2个化合物成分，30个靶点；获得淫羊藿23个化合物成分，208个靶点；获得当归2个化合物成分，51个靶点；获得牛膝20个化合物成分，199个靶点；获得黄芪20个化合物成分，194个靶点。

2.6.2 药物-疾病共同靶点交集：以“OP”为关键词，在人类基因综合分析数据库(GeneCards)、美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)及人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)进行人类基因检索，删重后得到OP相关基因共2 374个。将药物与疾病靶点输入Venny 2.1软件，得到109个共有靶点，见图3。

图3 药物-疾病交集靶点韦恩图Fig 3 Wayne diagram of drug-disease intersection target

2.6.3 PPI网络的构建：将109个共有靶点输入STRING数据库，设为“Homo sapiens”，得到109个节点，1 592条边，平均度值为29.2，绘制PPI网络图，见图4。通过Network Analyzer工具按度值排序，共筛选出49个关键靶点，绘制前20靶点条形图，见图5。

图4 关键靶点PPI网络Fig 4 PPI network of key targets

图5 关键靶点信息条形图Fig 5 Information bar diagram of key targets

2.6.4 成分-疾病靶点网络构建：通过Cytoscape 3.8.0软件构建成分-疾病-靶点网络图，见图6。

六边形代表中药；棱形代表活性成分；长方形代表疾病；圆形代表疾病靶点hexagons represent traditional Chinese medicine；prisms represent active ingredients；rectangles represent diseases；circles represent disease targets图6 成分-疾病-靶点网络Fig 6 Component-disease target network

2.6.5 GO功能富集分析：引用STRING数据库，以P<0.05进行筛选，得到1 939条生物过程(BP)、118项分子功能(MF)和42项细胞组成(CC)，见图7。

图7 关键靶点基因生物功能注释信息柱状图Fig 7 Biological function annotation information of key targets

2.6.6 KEGG通路富集分析：引用STRING数据库，以P<0.05进行筛选，得到159条信号通路，见图8。

图8 关键靶点KEGG通路富集分析Fig 8 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

2.6.7 成分-疾病-通路-靶点网络构建：将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape 3.8.0软件，绘制通路网络图，见图9。

六边形代表中药；棱形代表化合物；长方形代表疾病；圆形代表疾病靶点；三角形代表信号通路hexagons represent traditional Chinese medicine；prisms represent compounds；rectangles represent diseases；circles represent disease targets；triangles represent signaling pathways图9 成分-疾病-通路-靶点网络Fig 9 Component-disease-pathway-target network

3 讨论

3.1 药物使用频次分析

本研究纳入近年来中医药治疗OP的方剂104张，包括135味中药，其中使用频次≥30次的中药有14味。中医治疗OP以补益肝肾为主，居前3位的药味为熟地黄(66次)、淫羊藿(65次)及当归(52次)，“熟地黄→淫羊藿”组合出现频次最高，熟地黄擅补肾阴，淫羊藿擅补肾阳，二药配伍，增强了补肾壮骨的功效。而“山药→熟地黄”组合的关联性最高。山药具有补脾养胃、补肾涩精的功效，与熟地黄配伍应用，又具有收敛的作用，可滋阴益精，大补元气。采用层次聚类分析，共得到9个新方剂。

3.2 网络药理学分析

运用网络药理学方法，通过TCMSP、UniProt和GeneCards等数据库结合Cytoscape软件研究核心药对治疗OP的内在机制。核心药对与疾病的前10位共同靶点分别为白介素6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt1)、白介素1β(IL-1β)、宿主的原癌基因(JUN)、环氧合酶2(PTGS2)、半胱氨酸肽酶3(CASP3)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、雌激素受体1(ESR1)、原癌基因(FOS)和纤维连接蛋白1(FN1)。IL-6是促进破骨细胞增殖分化的重要因子[11]。淫羊藿苷通过降低骨质疏松模型小鼠骨组织中IL-6的表达，抑制骨质吸收，产生抗OP的作用[12-13]。Akt1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，激活Akt1可发挥多种生物效应，包括细胞增殖、代谢及血管生成等[14]；同时，可调控成骨分化和破骨分化[15]。网络拓扑分析得到核心药对治疗OP的主要活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素和汉黄芪素等。槲皮素属于黄酮类化合物，能促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞生成[16]，提高大鼠骨密度[17]。山柰酚属于黄酮醇，能抑制破骨细胞的骨吸收和促进成骨细胞的分化[18-19]。木犀草素能抑制氧化应激，促进细胞增殖及成骨细胞的分化[20]；同时，通过减少破骨细胞分化和降低骨吸收功能来预防绝经后骨质疏松症[21]。GO及KEGG富集结果显示，“熟地黄-当归-牛膝-黄芪-淫羊藿”核心药对治疗OP的生物过程有氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应及对营养水平的反应，分子功能涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合及信号受体激活剂活性等；涉及的主要信号通路包括晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)、脂质动脉粥样化、IL-17信号通路及肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。

综上所述，槲皮素、木犀草素和山柰酚等为治疗OP的重要有效成分，可通过作用于IL-6、Akt1和IL-1β等关键靶点，参与AGE-RAGE、脂质动脉粥样化、IL-17信号通路及TNF信号通路等达到治疗OP的作用。本研究运用数据挖掘及网络药理学方法为临床治疗OP提供了可借鉴的中药配伍，为下一步的实验研究奠定了理论基础。