基于Wnt/β-catenin信号通路探讨川芎提取物对慢性心力衰竭大鼠的干预作用Δ

高 嘉，黄冀娜，李 珍(保定市第二医院心血管内科，河北 保定 073000)

慢性心力衰竭(chronic heart failur，CHF)是由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重及炎症等原因引起的心肌损伤，患者临床表现主要为活动或生气时出现呼吸困难，还会出现消化不良、腹胀等症状[1-2]。川芎提取物是伞形科植物川芎根茎的提取物，可以抑制炎症反应、调控细胞凋亡、改善血管收缩功能，治疗心力衰竭[3-4]。Wnt信号通路可促进核内恶性肿瘤相关基因转录调节分子，其功能最常见于胚胎发育和恶性肿瘤，决定细胞的分化命运。Wnt/β-catenin信号通路也参与心脏重要的生物学进程，心脏受损后，Wnt/β-catenin信号促进心脏成纤维细胞的纤维化、瘢痕形成和有害心肌扩张[5-6]。本研究将通过诱导大鼠CHF模型，探讨川芎提取物对CHF大鼠的干预作用，并探究Wnt/β-catenin信号通路的变化，为临床使用川芎提取物治疗及辅助治疗CHF提供分子基础和依据。

1 材料

1.1 动物

雄性8～10周龄SPF级SD大鼠，购于北京维通利华实验动物中心。

1.2 仪器

Leica RM2015型切片机(德国Leica公司)；-80 ℃超低温保存箱(美国Thermo公司)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；SC-3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Western blot电泳仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 药品与试剂

川芎提取物购自广州朋远化工有限公司(批号：20150412，-20 ℃避光保存，使用时用2%吐温80先溶解，再用0.9%氯化钠溶液稀释，终浓度为5 mg/mL；戊巴比妥钠(批号：020919)购自天津市申泰化学试剂有限公司；苏木精(批号：H9627)、伊红(批号：861006)购于美国Sigma公司；去水平段极性蛋白3(Dvl3)抗体 (ab76081)、糖原合成酶激酶-3(GSKβ)抗体 (ab185141)、β-连环蛋白(β-catenin)抗体(ab32572)和二抗(ab150113)购于美国Abcam公司。

2 方法

2.1 大鼠分组及饲养条件

8～10周龄雄性SD大鼠于SPF级鼠房饲养，室温调节在(25±2)℃，相对湿度40%～65%，12 h/12 h昼夜交替照明，自由摄取食物和饮用水，适应性饲养1周后造模。

2.2 大鼠CHF模型的建立

大鼠称重后按10%水合氯醛0.4 mL/100 g行腹腔注射麻醉，将大鼠以背位固定于鼠板上，气管插管后将针形心电图导联电极刺入大鼠四肢，观察并记录心电图，暴露左侧胸腔，于左侧第3—4肋间开胸，逐层分离筋膜、肌肉，打开大鼠胸膜，挤压大鼠右侧胸腔，托举心脏，钝性撕开心包膜，于距离左冠状动脉前降支起点2 mm处用缝线结扎前降支，并予以利多卡因注射液0.1 mL防止发生室性心律失常。结扎结束后缝合，观测心电图可见ST段明显抬高，说明结扎成功。造模后半量饲料饥饿喂养，并对大鼠进行每日力竭式游泳1次[7]。

2.3 大鼠分组及给药

随机选择CHF大鼠20只，分为模型组和实验组。取10只未造模大鼠作为对照组。实验组大鼠使用川芎提取物(100 mg/kg)干预，1日1次，连续干预4周。对照组和模型组大鼠分别给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。

2.4 大鼠心脏苏木精-伊红(HE)染色

取出各组大鼠心脏后，对组织进行包埋后切片，进行脱蜡覆水，以苏木精染色5 min，5%乙酸1 min，伊红染色1 min，脱水：70%、80%、90%和100%酒精各10 s，二甲苯1 min，通风橱自然晾干再封片，于显微镜下进行检查[8]。

2.5 大鼠心肌组织超微结构观察

取各组大鼠左室心尖心脏组织，置于4%戊二醛固定液中，固定后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，1%锇酸固定，PBS清洗2次，脱水，包埋后制备心肌超薄切片，厚度50 nm，采用枸橼酸铅-醋酸铀双重染色后，经透射电镜观察大鼠心肌组织超微结构[9]。

2.6 大鼠实验终点心率及呼吸频率检测

实验终点采用大/小鼠脉搏血氧呼吸监护仪对各组大鼠心率及呼吸频率进行检测。测量时，保持室温在22～26 ℃，每次测量前，打开大鼠固定装置的电源开关，预热15～20 min，达到设定温度时加热灯泡自动熄灭，温度下降时灯泡自动开启，维持加热板在39～40 ℃；将待测大鼠放入预热箱中固定，露出尾部，安装袖带及光电容积搏动传感器，检测心率。呼吸频率采用注射麻醉，仰卧固定，记录呼吸频率。

2.7 大鼠实验终点大鼠左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室射血分数(LVEF)和左心室缩短分数(LVFS)检测

大鼠麻醉采用5%戊巴比妥钠(以0.9%氯化钠溶液溶解过滤)麻醉 4 min后立即检测；检测：通过M型超声心功能的测定仪检测大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS。

2.8 蛋白质印迹法检测大鼠心脏组织Dvl3、GSKβ和β-catenin蛋白的表达

对各组大鼠心脏进行研磨，采用RIPA蛋白裂解液心脏细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，80 V、15 min，120 V、2 h，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转模120 V、2.5 h，TBST漂洗3次(每次10 min)，使用5%脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3次(每次10 min)，加入一抗，二抗温孵育后，TBST漂洗3次(每次10 min)，超敏化学发光液显色，发光仪曝光、拍照[10-11]。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 CHF大鼠造模前后心电图变化情况

大鼠CHF造模前心电图表现为P波及PR间期明显，R波降支与T波相交；大鼠CHF大鼠造模后心电图显示T波低平或倒置明显，ST段较术前明显抬高或下降(绝对值≥0.1 mV)，见图1。

图1 CHF大鼠造模前后心电图比较Fig 1 Comparison of ECG in rats with chronic heart failure before and after modeling

3.2 CHF大鼠心脏HE染色比较

对照组大鼠心脏组织切片排列有序、细胞规则，心脏结构完整，未见明显细胞损伤；模型组大鼠细胞肿胀，心脏细胞边界不清晰，模糊，心肌细胞受损伤严重；实验组大鼠心脏损伤相对于模型组有明显改善，见图2。

图2 各组大鼠心脏HE染色情况比较(×200)Fig 2 Comparison of HE staining in heart of rats in each group (×200)

3.3 CHF大鼠心脏超微结构比较

对照组大鼠心肌细胞排列整齐，胞核及胞膜清晰，明暗带界限清，线粒体膜结构清晰，数量丰富，基质排列紧密，线粒体内脊形态清晰可见，同时糖原颗粒完整，整体上细胞间质也无水肿；模型组大鼠心肌排列紊乱，纤维断裂、消失，细胞间质出现水肿，线粒体数量减少且肿胀，线粒体内脊紊乱甚至消失；实验组大鼠心肌纤维结构较模型组均有改善，水肿有所减轻，糖原数量有所增加，线粒体空泡化相比与模型组有所改善，见图3。

图3 各组大鼠心脏超微结构比较(×10 000)Fig 3 Comparison of cardiac ultrastructure of rats in each group(×10 000)

3.4 各组大鼠实验终点心率及呼吸频率比较

模型组大鼠的心率和呼吸频率显著高于对照组，实验组大鼠的心率和呼吸频率显著低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠实验终点心率及呼吸频率比较次/min)Tab 1 Comparison of heart rate and respiratory rate of rats in each group at the end of experiment

3.5 各组大鼠实验终点LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比较

模型组大鼠的LVIDd、LVIDs显著高于对照组，LVEF、LVFS显著低于对照组；实验组大鼠的LVIDd、LVIDs显著低于模型组，LVEF、LVFS显著高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠实验终点LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平比较Tab 2 Comparison of LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS in each group at the end of experiment

3.6 各组大鼠心脏组织Dvl3、GSKβ及β-catenin蛋白表达水平比较

与对照组相比，模型组大鼠Dvl3、GSKβ和β-catenin表达水平有上升趋势；实验组大鼠Dvl3、β-catenin显著高于对照组，而实验组相比于模型组有显著下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

*P<0.05，**P<0.01；*P<0.05，**P<0.01图4 各组大鼠心脏组织Dvl3、GSKβ及β-catenin的蛋白表达水平Fig 4 Protein expression levels of Dvl3, GSKβ and β-catenin in heart tissues of rats in each group

4 讨论

CHF指持续存在的心力衰竭状态，是各种病因所致心脏疾病的终末阶段，其主要特点为呼吸困难、水肿和乏力，一般均有代偿性心脏扩大或肥厚及其他代偿机制参与，常伴有静脉压升高导致的器官充血性病理改变，可有心房、心室附壁血栓和静脉血栓形成，均可造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血和充盈功能低下[12-13]。川芎常用于活血行气、祛风止痛，其提取物成分主要为川芎嗪、黑麦草碱、川哚、藁本内酯和洋川芎醌等，具有辛散、解郁、通达及止痛等功能[14]。本研究通过结扎左冠状动脉前降支和竭力式游泳建立大鼠CHF模型，并给予大鼠川芎提取物干预，探究川芎提取物对大鼠心力衰竭的干预作用。结果表明，川芎提取物可以显著降低大鼠心脏组织的损伤，提高心肌组织线粒体结构的恢复。线粒体占心肌细胞中体积的35%～40%，心肌活动所需95%的腺苷三磷酸(ATP)均由线粒体产生。本研究结果提示，川芎提取物可以逆转线粒体受损，促进维持线粒体正常功能，进而部分恢复受损的心脏功能。本研究还发现，川芎提取物可以降低CHF引发的呼吸急促，缓解心率增快的病症，稳定大鼠的心肺功能。本研究通过进一步比较LVIDd、LVIDs、LVEF和LVFS水平，证实了川芎提取物能够改善大鼠心肌细胞收缩功能，起到恢复心脏功能、降低心脏损伤的作用。

Wnt/β-catetin信号通路是经典的Wnt信号通路，在进化过程中高度保守。Wnt/β-catetin由Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a和Wnt8激活，并参与转化。Wnt信号可通过上调Caspase抑制剂Survivin等抗凋亡蛋白来阻止细胞凋亡，并通过上调血管内皮生长因子来刺激血管生成。一些能够降解细胞外基质的蛋白酶，如供应基质裂解蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)7和MMP26，以及细胞黏附分子，如CD44和NrCAM，都是Wnt的靶基因，并且可以促进肿瘤的侵袭和转移。心脏受损后，Wnt/β-catenin信号同时参与心脏成纤维细胞的纤维化、瘢痕形成和有害心肌扩张，同时Wnt信号通路参与心肌梗死后心肌组织愈合过程的调控，参与心脏发育和心肌诱导分化等重要过程[15-16]。本研究结果表明，CHF大鼠的Wnt/β-catenin信号通路关键分子Dvl3、GSKβ和β-catenin表达水平显著升高，而川芎提取物干预后，Dvl3、GSKβ和β-catenin表达水平显著降低；同时，川芎提取物干预后Dvl3、β-catenin水平仍高于对照组，而GSKβ水平与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，提示川芎提取物对Dvl3、β-catenin的调控作用弱于对GSKβ的调控作用。GSKβ是进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以使磷酸基团加到β-catenin氨基端的丝氨酸/苏氨酸残基上，磷酸化的β-catenin被蛋白酶体降解，从而导致β-catenin表达水平降低。总体上，本研究推测，川芎提取物可以逆转CHF引发的Wnt/β-catenin激活，从而起到心脏保护作用。

综上所述，川芎提取物对CHF大鼠的心脏有保护作用，其作用机制与Wnt/catanin信号通路的抑制有关。