基于熊果酸的W/O/W型Pickering乳液制备方法

刘冬雪 肖 茜 刘成国 罗 洁 罗 扬 周 辉

(1. 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 长沙市农产品质量监测中心，湖南 长沙 410003)

Pickering乳液是指在互不相溶的两相界面上以固体颗粒作为乳化剂稳定的乳液[1]，一般可分为水包油(O/W)型、油包水(W/O)型以及多重(W/O/W，O/W/O)型乳液3种类型[2]，其中水包油包水(W/O/W)乳液是目前常见的一种乳液体系，被用于包埋、输送和保护生物活性成分、益生菌、风味物质等[3]。由于乳液是一种热力学不稳定的体系，会随着时间的推移导致体系分层、絮凝、转相及破乳[4]，Pickering乳液是由固体颗粒组成而非传统表面活性剂组成的稳定的新型乳液[5]，其稳定机制主要为固体颗粒吸附于油—水界面形成单层或多层界面膜，从而降低界面张力，达到稳定乳液的目的[6]，具有不可逆的界面吸附[7]、较高的聚结稳定性[8]、稳定粒径较大的液滴等优点。有研究[9]发现，在外水相中添加多糖如果胶、结冷胶、刺槐豆胶、黄原胶等充当增稠剂或胶凝剂，可以通过增加外水相的黏度或改善外水相界面特性来改善多重乳液的稳定性。

熊果酸(Ursolic Acid)又名乌苏酸，是一种广泛存在于植物中的一类三萜类化合物[10]。研究表明，熊果酸具有多种生物学活性，如抗氧化[11]、抗病毒、抗肿瘤和保护心血管[12-13]，且毒性低，不良反应少[14]，具有广泛的开发前景，但水溶性差，生物利用度低[15]，在使用上受到限制。熊果酸也可作为药物、食品的Pickering乳化剂[16]，然而由熊果酸作乳化剂制备双重乳液的研究鲜少报道。

研究拟以熊果酸为乳化剂，以果胶为外水相，采用两步法制备W/O/W型Pickering双层乳液，研究果胶质量浓度对Pickering双重乳液形成、微观结构、粒径和zeta电位的影响，以期为熊果酸稳定的W/O/W乳液体系输送和控释食品功能成分提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽油：道道全粮油股份有限公司；

熊果酸：纯度98%，西安瑞林生物科技有限公司；

脱脂乳粉：食品级，澳优乳业(中国)有限公司；

果胶：食品级，河南万邦实业有限公司。

1.2 仪器与设备

激光粒度仪：Master sizer 3000型，英国Malvern公司；

电位测定仪：Nano-ZS型，英国Malvern公司；

旋转流变仪：Kinexus pro+型，英国Malvern公司；

高速匀浆机：Ultra-Turrax®T25型，德国IKA公司；

显微镜：DM2000型，德国徕卡公司；

恒温磁力搅拌器：DF-101S型，郑州市亚荣仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 W/O单层乳液的单因素试验 以乳析指数为指标，固定熊果酸质量浓度为3 g/100 mL、均质转速为9 000 r/min、均质时间为3 min，考察水油质量比(m脱脂乳∶m菜籽油为1∶2，1∶3，2∶3，3∶5)对乳析指数的影响；固定m脱脂乳∶m菜籽油为2∶3、均质转速为9 000 r/min、均质时间为3 min，考察熊果酸质量浓度(1，2，3，4，5 g/100 mL)对乳析指数的影响；固定m脱脂乳∶m菜籽油为2∶3、熊果酸质量浓度为3 g/100 mL、均质时间为3 min，考察均质转速为(6 000，7 000，8 000，9 000，10 000 r/min)对乳析指数的影响；固定m脱脂乳∶m菜籽油为2∶3、熊果酸质量浓度为3 g/100 mL、均质转速为9 000 r/min，考察均质时间(1，2，3，4，5 min)对乳析指数的影响。

1.3.2 乳析指数测定 将5 mL乳液转移到玻璃瓶中，用塑料盖密封后于室温下贮藏，放置7 d后测量乳液析出层高度。按式(1)计算乳析指数。

(1)

式中：

X——乳析指数，%；

H0——析出层高度，mm；

H——总体高度，mm。

1.3.3 W/O/W双层乳状液的制备 配制质量浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/100 mL果胶溶液与最佳工艺制备的初乳W/O按m果胶∶m初乳=3∶2的比例混合，以6 000 r/min 剪切2 min，制得W/O/W型多重乳状液。

1.3.4 显微镜观察微观结构 取10 μL乳液滴加至载玻片上，盖玻片缓慢盖上防止产生气泡，用光学显微镜进行观察，获得乳液显微结构图像。

1.3.5 粒径和zeta电位的测定 乳液粒径用Master sizer 3000型激光粒度仪测定[17]，采用体积平均直径D[4，3]表征乳液粒径；采用Nano-ZS型电位测定仪测定乳液的zeta电位[18]，每个样品3组平行，结果取平均值。

1.3.6 W/O/W双层乳状液的流变特性 采用Kinexus pro+型旋转流变仪进行测量。取2 mL待测乳液于旋转流变仪载物台上，选择40 mm的2°锥形钢板夹具，设置平板转子与底盘之间的距离为1 mm，温度25 ℃。在固定应变(1%)下，测量储能模量(G′)和损耗模量(G″)随频率(0.1～10 Hz)的变化。在0.1～100 s-1的剪切速率范围内测定乳液的表观剪切黏度。

1.3.7 4 ℃贮藏稳定性分析 测量贮藏1，7，15，30 d后乳液的粒径和zeta电位，每个样品3组平行，结果取平均值。

1.3.8 数据分析 用Excel 2019和Origin 2021进行数据的处理、分析及绘图，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 W/O单因素试验

2.1.1 水油质量比对W/O单层乳液乳析指数的影响

由图1可知，随着油相体积的增大，乳析指数逐渐增大，当水油质量比为2∶3时，乳析指数为1.10%，与其他组有显著性差异(P<0.05)；当油相比例增加，油水界面所吸附的熊果酸固体颗粒的量减少，形成的界面张力不足以稳定水油界面使得乳液分层率增加，使乳液难以达到良好的稳定状态。因此，选择最佳油水质量比为2∶3。

字母不同表示有显著性差异(P<0.05)

2.1.2 熊果酸质量浓度对W/O单层乳液乳析指数的影响 由图2可知，随着熊果酸固体颗粒含量的增加，乳液乳析指数呈先降低后趋于平稳的趋势，当熊果酸质量浓度为4，5 g/100 mL时，乳析指数为1.29%，1.02%，无显著性差异(P>0.05)，可能是由于乳化过程中，熊果酸质量浓度高，其在W/O界面所能稳定的面积大，而低质量浓度的熊果酸能稳定W/O界面面积小，使得固体颗粒之间间隙相对增大[19]，造成油滴的聚集析出，最终导致乳析指数增大；当熊果酸增加到临界点时，多余的熊果酸分散在连续相中，不再吸附于水油界面稳定乳液，而是填充到乳液间隙中[7]，对乳液乳析指数的影响不显著。因此，选择最佳熊果酸质量浓度为4 g/100 mL。

字母不同表示有显著性差异(P<0.05)

2.1.3 均质转速对W/O单层乳液乳析指数的影响 由图3可知，随着均质转速的增大，乳液乳析指数逐渐减小，当均质转速为9 000～10 000 r/min时，乳液的乳析指数不再出现显著性变化(P>0.05)，可能是由于均质转速的增大带来强烈的剪切力，减小了水分子之间迁移速率[20]，使乳液获得更有效的乳化，提高了乳液的稳定性。因此，选择最佳均质转速为9 000 r/min。

字母不同表示有显著性差异(P<0.05)

2.1.4 均质时间对W/O单层乳液乳析指数的影响 由图4可知，乳液乳析指数随着均质时间的增加而减小，当均质时间为5 min时，乳析指数为0.64%，乳液稳定效果最佳，这是由于乳液的稳定性主要是依靠液滴之间的静电排斥力来维持[21]，均质时间的增加提高了W/O界面强度，从而使液滴之间的静电排斥力增强，提高了乳液的稳定性；相反，均质时间过短则达不到稳定乳液的目的，乳化过程结束后，油相便在贮藏过程中逐渐析出，导致乳液稳定性下降。因此，选择最佳均质时间为5 min。

字母不同表示有显著性差异(P<0.05)

2.2 W/O/W乳液光学显微镜镜下结构

以前期试验结果为基础，选择二次乳化转速6 000 r/min，时间2 min，以研究果胶质量浓度对W/O/W乳液稳定性的影响。不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液的光学显微结构见图5。

由图5可知，W/O/W乳液均有三相两膜结构[22]，分散状态较好，乳液液滴大多呈圆球形，且大小较为均匀。不同质量浓度的果胶都能够制备出稳定的W/O/W乳液，在W/O/W乳液内部包裹着大量的W/O小乳滴；在4 ℃下放置30 d后，0.1，0.2 g/100 mL的果胶溶液制备的乳液液滴变大，乳液出现明显的相分离，表明低质量浓度的果胶不足以形成致密的界面膜，因而很难保持W/O/W乳液的贮藏稳定性；当果胶质量浓度≥0.3 g/100 mL时，乳液无水相析出，有着稳固的界面层屏障，可能是由于高质量浓度的果胶能够抵抗液滴之间的碰撞聚结、增强两相之间的界面膜强度[23]，使双重乳液具有优越的贮藏稳定性。

图5 不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液的显微镜图Figure 5 Micrographs of W/O/W emulsions prepared with various mass concentrations of pectin

2.3 W/O/W乳液粒径、zeta电位分析

由图6可知，随着果胶质量浓度的增大，W/O/W乳液的粒径无显著性差异，粒径大小为(36.2±2.0) μm。果胶质量浓度对粒径无显著性影响，与显微镜结果基本一致，表明不同质量浓度的果胶均能制备出粒径分布均匀的乳液；而W/O/W乳液的电位绝对值呈增长趋势。当果胶质量浓度为0.3，0.4，0.5 g/100 mL时，乳液的zeta电位绝对值无显著性差异，可能是由于果胶为阴离子多糖[24]，当果胶质量浓度达到一定水平时，多余的果胶分散于连续相中，不再吸附于水油界面，而是填充到乳液间隙中，所以过多的果胶存在并不会增加液滴的表面电荷。

图6 不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液的粒径和zeta电位

2.4 W/O/W乳液流变特性分析

由图7可知，当剪切速率不断增加时，以不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液的表观黏度逐渐减小，呈现出剪切稀化的现象，说明该W/O/W乳液属于非牛顿假塑性流体[24]。同时，随着果胶质量浓度的增加，W/O/W乳液的表观黏度呈逐渐增大的趋势，其流动性也相应地减弱，这是由于增大果胶浓度促使W/O/W乳液中外水相的稠度提高，使表观黏度逐渐增大，能够防止W/O/W乳液内部水油界面之间的液滴聚结，从而达到稳定效果；另外，对于不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液，其储能模量始终大于损耗模量，说明弹性主导W/O/W乳液网状结构的形成，双层乳液体系呈现为类弹性固体性质[25]，W/O/W乳液的G′与G″均随着外水相中果胶质量浓度的增大而增大，这归因于果胶质量浓度的增加形成了更加致密的网络结构，以上结果说明将果胶添加至连续相中可以一定程度上改善W/O/W乳液的稳定性、黏弹性及抗形变能力，而且果胶的加入有利于乳液液滴间形成致密的凝胶网络。

图7 不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液的黏度、储能模量(G′)和损耗模量(G″)Figure 7 Viscosity, storage modulus (G′) and loss modulus (G″) of W/O/W emulsions prepared with various mass concentrations of pectin

2.5 W/O/W乳液4 ℃贮藏稳定性分析

由图8可知，当果胶质量浓度较低(≤0.2 g/100 mL) 时，乳液经4 ℃贮藏30 d后双层乳液出现一定程度分层，粒径逐渐增大，zeta电位绝对值在前14 d缓慢减小，第30天时显著减小，表明低质量浓度果胶不能维持乳液的长期稳定性，可能是由于低浓度外水相的双层乳液中含有较少果胶附着的界面不能提供足够的静电斥力来保证乳液的长期贮藏稳定性[26]；当果胶质量浓度较高时，乳液经4 ℃贮藏30 d后双层乳液无分层现象，粒径无显著性变化，zeta电位绝对值从相对稳定到逐渐增大，表明果胶质量浓度的增加提高了双层乳液的稳定性，可能是由于双层乳液中外水相黏度不断增加，相互交联形成致密的网络结构，防止体系内部液滴的聚结[27]，从而提高乳液的长期贮藏稳定性。

图8 不同质量浓度果胶制备的W/O/W乳液贮藏期间的粒径和zeta电位Figure 8 Particle size and zeta potential of W/O/W emulsions prepared with various mass concentrations of pectin during storage

3 结论

试验研究了不同果胶质量浓度下，熊果酸作为W/O/W乳液的Pickering乳化剂对乳液稳定性的影响。结果表明，以熊果酸为新型乳化剂可以成功制备出具有优良长期贮藏稳定性的乳液，果胶质量浓度对W/O/W乳液稳定性提高有着明显的影响。由流变结果可知W/O/W乳液属于具有剪切变稀这一流变特性的非牛顿流体，当果胶质量浓度≥0.3 g/100 mL时，虽然提高了体系的黏度和黏弹性，但并未显著改变乳液的粒径和zeta电位；控制果胶的质量浓度能够一定程度改善双重乳液的黏弹性。表明从乳液组分、结构和质地等角度出发，可以设计和构建具有新型功能化的乳液。