海水胁迫下冰草幼苗期耐盐性指标筛选

苗涵，魏莱，杨燕萍，车永和

（1. 河北省作物逆境生物学重点实验室，河北 秦皇岛 066000；2. 河北科技师范学院农学与生物科技学院，河北 秦皇岛 066000）

土壤盐渍化是影响作物产量的主要非生物胁迫因子之一，受盐胁迫影响，世界粮食产量至少减少20%［1］。在盐渍化土壤类型中，滨海盐土占有很大比例，我国海岸线漫长，滩涂面积约217.04 万hm2［2］，生产潜力较大，咸水资源（约2.00×1010m3·a-1）十分丰富，其中可开采量为1.30×1010m3，且绝大部分存在于地下10～100 cm 处，宜于开采利用［3-5］。除东部滨海盐土与海涂，黄淮海平原及东北平原地区的盐碱地面积达2 亿hm2［6］，因此，如何合理、有效地利用盐渍化土壤，使其发挥土地资源的宝贵价值，成为未来农业发展亟待解决的重要课题。而在多种耐盐碱改良措施中，利用耐盐碱的植物对土壤进行改良是最为生态科学的［7］。草本牧草是盐碱地生态植被的重要组成成分，对盐碱地生态修复有着重要的作用［8］，耐盐碱牧草可通过根系的延伸改变土壤结构和根系微环境，增加土壤有机质含量，进而改善盐碱地小气候，从而能够抑制土壤盐分的积累［7-8］。

冰草属（Agropyron）植物为禾本科多年生异花授粉植物［9］，饲用价值高，具有较强的抗旱、抗寒、抗病和耐盐碱性，是盐碱地改良的优良作物［10］。其中，冰草Agropyron cristatum是冰草属的典型物种，其基因组倍性水平多样，包括二倍体（2n=2x=14，PP）、四倍体（2n=4x=28，PPPP）和六倍体（2n=6x=42，PPPPPP）［11］。目前，我国育成的冰草品种有内蒙沙芦草、蒙农杂种冰草和蒙农1 号蒙古冰草，其中蒙农杂种冰草较其他材料具有更强的适应性和耐盐碱性［12］，既可用做水土保持植物，又可作为优良饲草作物。目前国内关于冰草耐盐性的研究，主要是针对盐胁迫对冰草种子萌发和幼苗生长的影响［13-15］，多采用以单盐（如NaCl）或复盐（如NaCl 和Na2SO4）来模拟盐碱胁迫。本研究选用我国冰草主栽品种，在幼苗期采用不同海水浓度胁迫，对其进行耐盐性评价，通过测定海水盐胁迫下的农艺性状和生理指标，计算其耐盐系数；并利用主成分分析法和模糊数学隶属函数法进行数据分析，从而优化冰草种质海水胁迫鉴定体系，以期为冰草种质耐盐碱评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试材料为从内蒙古农业大学引种的目前国内2 个冰草主栽品种，蒙农1 号蒙古冰草（Agropyron mongolicumcv. Mengnong No.1，简称蒙冰）和蒙农杂种冰草（A. cristatum×Agropyron desertorumcv. Hycrest-Mengnong，简称蒙农）。

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗的培育 于2021年6 月选取籽粒饱满的供试冰草种子，经0.1% KMnO4溶液浸泡消毒3 min，去离子水清洗3 遍后，置于湿润的铺有灭菌滤纸的培养皿中，用去离子水处理发芽。期间保持适宜生长的水分，去除发霉、死亡和腐烂的种子，放入智能人工培养箱，培养温度为25 ℃，湿度为60%，光照设置为14 h，黑暗10 h。每隔1～2 d 更换一次滤纸，保持培养皿和滤纸无污染。取大田土壤（取自河北省秦皇岛市昌黎县施各庄农学试验站）和草木灰过筛，将二者按照3∶1 的比例混合均匀，装入塑料花盆中（高22.0 cm，底径16.5 cm，口径26.5 cm），每盆装入干土4 kg。于2021年6 月中旬挑选发育良好、生长一致的幼苗进行移栽，每盆种植100 株；于2021年6月下旬2 叶前进行间苗，每盆保留50 株株高一致、生长状况良好的幼苗，进行盐胁迫试验。在花盆内培养供试冰草期间用清水浇灌，土壤含水量为最大含水量的70%左右。

1.2.2 海水胁迫处理 参照本课题组筛选出的成株期冰草海水浇灌适宜浓度进行盐胁迫浓度优化［12］。本试验设置5 个浓度梯度：30%、40%、50%、60%和70%（体积浓度）的海水，对照组为清水，对照组和试验组均为3 次重复处理。本研究海水于2021年4 月取自河北省秦皇岛市昌黎黄金海岸，将海水取样蒸发后得到固体结晶物质，测得海水质量浓度为2.724%。

根据《冰草种质资源描述规范和数据标准》［16］中规定的冰草苗期耐盐处理方法进行海水胁迫处理，略有调整。用不同浓度的海水进行浇灌，每天利用土壤湿度计测量土壤湿度，用清水及时补充蒸发的水分，使海水处理后的土壤保持水分含量为最大含水量的70%左右，30 d 后用锡纸采集冰草叶片样品，放入液氮罐带回实验室-80 ℃保存，用于生理指标测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 幼苗生长相关指标 每盆随机选择幼苗12 株，用直尺测定每株幼苗的垂直高度，统计后取平均值作为统计株高，用清水小心冲洗根部，避免损伤，冲洗干净后测量根长；以称重法称量苗鲜重、根鲜重。将称量完鲜重的苗和根置于烘箱中105 ℃杀青15 min、65 ℃烘干24 h 后称量苗、根干重，进而计算相对含水量［17］。

1.3.2 生理指标 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量用硫代巴比妥酸氧化比色法测定［18］；脯氨酸（proline，Pro）含量用磺基水杨酸法测定［19］；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性用氮蓝四唑光还原法测定［20］；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈创木酚比色法测定［20］；可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量用考马斯亮蓝法测定［20］；可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮比色法测定［21］；Na+、K+含量采用火焰光度法测定［22］。每个样本指标进行3 次重复检测。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2010 和Prism 9 进行数据的录入和作图等，采用SPSS 25.0 进行差异性统计分析（One-Way ANOVA），构建相关性模型。

单项指标耐盐系数计算公式如下：

各综合指标的隶属函数值计算公式如下：

式中：μ(Xj)表示第j个综合指标的隶属函数值；Xj表示第j个综合指标值；Xmin表示第j个指标最小值；Xmax表示第j个指标最大值，指标与耐盐性呈正相关用隶属函数公式（2）计算，指标与耐盐性呈负相关用反隶属函数公式（3）计算。

各综合指标的权重计算公式如下：

式中：Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Vj表示经过主成分分析所得材料各部分综合指标的贡献率。

耐盐综合评价值计算公式如下：

式中：D值为冰草种质材料在盐胁迫下综合指标评价所得的耐盐性综合评价值。

2 结果与分析

2.1 海水盐胁迫对冰草苗期生长特征的影响

海水盐胁迫下，不同冰草材料的生长表现不同（图1）。蒙冰的根长相较于对照组显著变短，且各浓度间无显著差异。蒙农在40%和50%浓度处理时的根长长于对照组，且在50%处理时达到最长，最短的是30%浓度处理，各处理与对照组之间无显著差异。在株高方面，两个材料均为对照组株高最高，随着盐胁迫浓度的增加，株高逐渐降低，在70%浓度时最低。两个材料的苗相对含水量在不同浓度处理下均无显著差异。蒙冰的根相对含水量在不同浓度处理下均无显著差异；而蒙农则在盐胁迫下根部相对含水量显著高于对照，但在50%浓度时与对照无显著差异。

图1 不同浓度海水胁迫下冰草材料的形态指标和相对含水量Fig.1 Morphological indexes and relative water content of Agropyron under different seawater concentration不同字母代表同一种冰草材料在不同浓度之间差异显著（P＜0.05），下同。Different letters represent the significant differences（P＜0.05）of the same material of Agropyron under different seawater treatment，the same below.

2.2 海水盐胁迫对冰草苗期叶片K+、Na+的影响

海水盐胁迫下，不同冰草材料的K+、Na+含量表现出相同的变化趋势（图2）。Na+含量随着盐胁迫程度的增加而增加，海水浓度在70%时达到最高；当处理小于40%浓度时（CK 和30%浓度），Na+含量蒙农低于蒙冰；在40%、50%、60%和70%浓度时，蒙农的Na+含量与蒙冰相比，分别增加了18.09%、0.27%、41.19%和35.00%。K+含量随着盐胁迫程度的增加而减少，在海水浓度70%时达到最低；在各浓度下蒙冰K+含量均高于蒙农，增幅分别为2.43%、1.36%、9.68%、8.15%、8.90%和29.44%。

图2 不同浓度海水胁迫下冰草材料的Na+、K+浓度Fig.2 Na+and K+ concentration of Agropyron under different seawater concentration

蒙冰和蒙农的K+/Na+均随着海水浓度的增加而降低（图3）。对照组的K+/Na+显著高于各海水浓度处理。蒙冰和蒙农的K+/Na+均在70%浓度时最低，蒙农的K+/Na+在各浓度海水处理之间无显著差异。

图3 不同海水浓度下冰草材料的K+/Na+Fig. 3 K+/Na+ of Agropyron under different seawater concentration

2.3 盐胁迫对冰草苗期渗透调节物质的影响

由图4 可知，海水盐胁迫下，抗氧化酶SOD 和POD 活性增高，不同浓度处理下蒙冰抗氧化酶活性始终高于蒙农。SOD 活性在70%浓度时最高；POD 活性在50% 浓度时最高，大于该浓度时则有所下降，70%浓度时最低，与对照相比无显著差异。当盐胁迫浓度大于50%时，蒙冰和蒙农MDA 含量显著升高。Pro 含量也随着盐胁迫程度的加剧而逐渐增加，蒙冰和蒙农均在70%浓度时最高。SS 和SP 含量在盐胁迫下出现显著下降的趋势，但在70%浓度时又开始增加。

图4 不同海水浓度下冰草材料的抗氧化酶活性和渗透调节物质含量Fig. 4 Antioxidant enzyme activity and osmotic adjustment substance content of Agropyron under different seawater concentration

2.4 各单项指标的耐盐系数及相关性分析

根据公式（1）计算冰草幼苗期各指标耐盐系数，由表1 可知，两个参试材料的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、脯氨酸（Pro）、钠离子（Na+）和根相对含水量（relative water content of root，RWCR）6 个指标盐胁迫与对照相比均有所增加（ω＞1）。可溶性蛋白（SP）、可溶性糖（SS）、钾离子（K+）、株高（shoot height，SH）和根长（root length，RL）5 个指标盐胁迫与对照相比均有所下降（ω＜1）。

不同材料在不同海水浓度处理下其耐盐系数存在显著差异（表1）。一般来说，盐胁迫下MDA 含量升高，但在本研究中50%浓度时出现了低于对照（ω＜1）的情况。蒙冰和蒙农SOD 含量均随着海水胁迫浓度的增加而上升。根长（RL）随着海水胁迫程度的加剧而变短，但蒙冰材料在40%和50%浓度海水胁迫下，其根长比对照增长了14.1%和26.6%（图1）。

表1 不同海水浓度下冰草幼苗耐盐系数Table 1 Saline tolerance coefficient for the seeding stage of Agropyron under different seawater concentration

蒙冰和蒙农的苗相对含水量（RWC-S）在不同海水处理下耐盐系数均无显著差异。图1 中，蒙农的株高（SH）和根相对含水量（RWC-S）在不同浓度处理下无显著差异。蒙冰的根相对含水量（RWC-R）在50%浓度处理下其耐盐系数显著低于除60%以外的其他处理，株高（SH）在70%浓度处理下显著低于其他浓度处理。

以上分析可以看出，不同材料在不同海水处理下耐盐单项指标变化幅度不尽相同，且各指标在耐盐性中所起作用大小也不同，这说明冰草耐盐性是一个复杂的综合结果，直接利用单项指标不能准确直观地进行耐盐性评价。为了弥补单项耐盐指标的不足，需要在此基础上进一步利用其他多元统计方法进行分析。

对两个冰草材料的不同浓度海水处理后的12 个指标进行相关性分析（表2）发现，各指标之间存在显著和极显著相关关系：SOD 与SS 呈显著负相关（相关系数为0.560）；POD 与SS 呈极显著负相关（相关系数为0.643），与RWC-R 呈显著正相关（相关系数为0.598）；SS 与Pro 呈极显著负相关（相关系数为0.662）；Pro 与Na+呈显著正相关（相关系数为0.574），与SP 呈显著负相关（相关系数为0.562）；Na+与MDA 呈极显著正相关（相关系数为0.805），与SP 呈极显著负相关（相关系数为0.938），与SH 呈显著负相关（相关系数为0.594）；MDA 与SP 呈极显著负相关（相关系数为0.764），与SH 呈显著负相关（相关系数为0.558）；SP 与SH 呈显著正相关（相关系数为0.570）。这说明了冰草种质资源在不同浓度海水胁迫下各个指标之间具有相关性，它们所反映的信息具有一定程度的重合与交叉性。

表2 各耐盐指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis of salt tolerance coefficients

2.5 供试冰草种质材料耐盐指标的主成分分析

对供试冰草材料进行主成分分析（表3），结果表明：第1 主成分的贡献率为30.874%，第2 主成分的贡献率为20.411%，第3 主成分的贡献率为16.727%，第4 主成分的贡献率为10.713%，前4 主成分累积贡献率达到78.725%，基本代表了试验材料所测指标的大部分信息。因此，选取前4 个主成分作为冰草种质资源耐盐性评价的综合指标（表4）。

表3 主成分分析Table 3 The result of principal component analysis

表4 各因子载荷矩阵Table 4 Factor loading

第1 主成分中对应较大的特征向量有过氧化物歧化酶（SOD）、Na+、K+、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）。盐胁迫会使细胞膜脂过氧化从而产生丙二醛，说明植物细胞离子平衡被破坏，SOD 则是植物抗氧化系统的主要酶之一，可溶性蛋白为重要的渗透调节物质，说明第1 主成分主要是细胞渗透调节与抗氧化系统相关的指标，尤其是与细胞渗透调节相关，且Na+因子载荷最大，故称第1 主成分为渗透调节因子。

第2 主成分中对应较大的特征向量有株高（SH）、根长（RL）和脯氨酸（Pro）。该指标除了脯氨酸均为正向标，说明株高越高、根长越长，相比较矮小、根系不发达的植株其耐盐性越强。因株高（SH）和根长（RL）与植株形态指标相关，故称第2 主成分为株型因子。

第3 主成分中对应较大的特征向量有可溶性糖（SS），其作用主要是参与细胞的渗透调节与信号转导，与脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白（SP）具有相同的作用，与第1 主成分作用相同，同为渗透调节因子。

第4 主成分中对应较大的特征向量为根含水量（RWC-R），故称第4 主成分为根系因子。根是植物的主要吸水器官，一般来说，在相同盐胁迫条件下，根系较深的植株吸水保水能力更强，而根系浅的植株吸收不到土壤深处的水，严重影响其地上部分的生长。

2.6 隶属函数分析

根据因子载荷计算各主成分的综合指标值（comprehensive index，CI），根据隶属函数公式（2）和（3），计算试验材料不同海水处理下相对应的隶属函数值μ(Xj)；根据公式（4）计算4 个主成分的权重分别为0.392、0.259、0.212、0.136；根据公式（5），计算出耐盐综合评价值D。D值代表了冰草种质资源材料在盐胁迫下综合指标评价所得的耐盐性综合评价值，两种材料表现出相同的趋势，D值均随着海水胁迫程度的增加而变小，说明材料的耐盐性降低。同时，从D值来看，除了30%浓度海水处理下耐盐性蒙农低于蒙冰，其他各浓度处理下耐盐性均为蒙农大于蒙冰。因此，综合来说蒙农的耐盐性更高。

2.7 耐盐指标选择及回归模型建立

将耐盐性综合评价D值做因变量，各单项指标耐盐系数做自变量进行回归分析，建立最优回归方程：D=0.833-0.018SOD-0.147SP-0.042SS-0.142 Pro-0.004Na+-0.520K+-0.076RL，方 程R2为0.993，达极显著水平（P＜0.01）。

由方程可以看出，通过主成分分析得出的12 个耐盐指标中有7 个指标对冰草材料种质资源具有显著影响，分别是SOD、SP、SS、Pro、Na+、K+和RL。利用所得的回归方程对不同海水处理进行耐盐性预测，得到耐盐性预测值（表5），对回归方程的估计精度进行评价（表6），结果表明各海水浓度处理下的预测值估计精度在94.13%以上，说明该方程中的7 项指标对冰草耐盐性影响显著，可用此方程进行冰草种质资源材料的耐盐性评价。同时，可在相同条件下，测定其他冰草品系的上述7 项指标，并求得耐盐系数，进而利用该方程预测冰草耐盐性。

表5 不同海水浓度处理下各指标的综合指标值、隶属函数值、耐盐综合评价值D 及预测值Table 5 The values of the comprehensive index value，subordinative function value，D value，and prediction value under different seawater treatment

表6 回归方程的估计精度分析Table 6 Analysis of estimation precision of regression equation

3 讨论

研究人员已经对于植物耐盐性方面做了大量的工作，研究表明植物对于盐胁迫的调节机制主要有渗透调节、抗氧化酶系统调节和胁迫信号转导系统调节［23］。在盐胁迫下，植物通过自身调节来减轻盐胁迫，一般分为渗透效应和离子效应［24］。Na+是造成植物盐害的主要离子，与K+存在竞争关系［25］，在盐胁迫过程中，K+能够在不同组织间重新分配和调节气孔［26］，使根系在水分和养分吸收方面具有重要作用［27］。本研究中Na+、K+指标在主成分分析中位于第1 主成分且因子载荷较大，此外，本研究中K+/Na+的变化十分显著，呈现显著降低的趋势，说明在盐胁迫下，植物的离子区域化起着十分重要的作用，细胞内K+/Na+浓度的平衡是保证植物在盐胁迫下进行正常生理代谢的关键；这与前人研究结果［28-30］一致，说明K+、Na+和K+/Na+是植物耐盐性评价中十分重要的指标。

除了离子区域化外，在长期的进化过程中，植物还可以通过积累一些渗透调节物质来调节渗透势、消除活性氧以及维持蛋白结构［31］，例如可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等［32］。本研究通过主成分分析法得到的主成分因子结论与此一致。

盐胁迫下冰草材料的生长特征中，根长和株高具有显著变化；苗相对含水量在各材料各处理间无显著变化，根相对含水量一个材料处理间有显著变化，但并不规律，同时在主成分分析中相对含水量位于最后一位影响因子，因此耐盐性预测表达式中应舍弃掉相对含水量。盐胁迫能够抑制根部的生长，但在低浓度下因材料耐盐性不同反而促进根的生长，即“引发作用”［33］，本研究中蒙冰材料在盐胁迫下根长的变化与之有一定的相似性。

在高盐胁迫条件下，植物体内SOD 等酶的活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关［34］，但本研究中蒙农在高盐胁迫下SOD 以及SS 和SP 含量出现降低的情况，这可能是由于高盐胁迫使具有较高耐盐性的蒙农能够通过自身调节，进行离子区域化，加上其他渗透调节物质的作用，各指标之间相互影响，一定程度上缓解了高盐胁迫。MDA 是反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标，其含量可说明植物遭受逆境伤害的程度［32］。在本研究中，两个冰草材料在60%和70%浓度时MDA 含量显著升高，说明在高于60%浓度时冰草体内因盐胁迫造成了细胞膜的破坏，伤害程度较大；在低于60%浓度时与对照无显著差异，说明冰草受到伤害较小。研究表明大部分植物在含盐量达0.3%的土壤中会受到伤害［35］，但在本研究中30%海水浓度时盐分含量即达到了0.817%，证实了两个冰草材料具有较高的耐盐性；通过隶属函数分析，计算得到的综合耐盐性D值来看，蒙农耐盐性高于蒙冰，试验分析结果与田间生产实际吻合。

本研究对不同冰草材料在不同海水浓度处理下进行相关性分析得出，各指标之间显著和极显著相关，说明它们所反映的信息具有一定程度的重合与交叉性，单个指标无法反映其耐盐程度，具有片面性；主成分分析法可简化数据结构，通过主成分能够确定哪些变量应该保留或者剔除，从而分析各指标与耐盐性之间的关系，筛选出可靠的耐盐性鉴定指标，可弥补单个指标的片面性。从计算所得到的综合耐盐性D值来看，两个冰草品种表现出相同的趋势，即随着海水胁迫程度的增加，D值变小，说明盐胁迫浓度增大，冰草材料耐盐性降低。生理指标的变化说明了冰草能够通过自身的调节来适应盐分胁迫。

将耐盐性综合评价D值做因变量，各单项指标耐盐系数做自变量进行逐步回归分析，建立最优回归方程，进而能够通过方程评价冰草材料耐盐性。建立可用于冰草种质资源苗期耐盐性评价的数学模型，不仅使得耐盐性鉴定工作简单化，而且可快速预测其他种质材料的耐盐能力。

4 结论

1）通过主成分分析法将海水胁迫处理下冰草种质材料的12 个生理指标提取出4 个主成分，累积贡献率达到78.725%；总结出3 个盐胁迫因子，分别为渗透调节因子、株型因子、根系因子。

2）通过隶属函数分析法分析得到冰草种质材料10 个耐盐指标：过氧化物歧化酶（SOD）、Na+、K+、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、株高（SH）、根长（RL）、根含水量（RWC-R），其中K+和Na+是植物耐盐性评价中十分重要的指标。

3）通过回归分析方法建立了冰草种质材料苗期耐盐性预测回归模型：D=0.833-0.018SOD-0.147SP-0.042SS-0.142Pro-0.004Na+-0.520K+-0.076RL，SOD、SP、SS、Pro、Na+、K+和RL 这7 项指标对冰草种质耐盐性具有显著影响；可用该模型进行在海水胁迫下种质资源耐盐性强弱的快速预测，为冰草种质资源评价提供科学依据。