盐城地区4 429例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及产前诊断

张庆娥,郑建丽,李 敏,董晶晶,周月云,刘建兵,胡苏玮

(1.扬州大学，江苏扬州 225002；2.江苏省盐城市妇幼保健院产前诊断中心 224001；3．扬州大学医学院附属扬州市妇幼保健院医学遗传中心，江苏扬州 225002)

脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种常染色体隐性遗传性疾病，其特征是脊髓前角细胞和脑干运动性脑神经核的运动神经元进行性退变。该病的临床表现主要为进行性对称性肌无力和肌肉萎缩。临床症状在近端比远端更严重，下肢比上肢更严重[1]。该病可分为4型：急性婴儿Ⅰ型、慢性婴儿Ⅱ型、青少年Ⅲ型和成人Ⅳ型。该病在人群中的发病率为1/6 000～1/10 000，致病性突变的携带频率为1/60～1/40[2]。SMA在儿童致死性常染色体遗传病中排名第二，约80%的患儿在4岁前死亡。

据研究，SMA是由位于5号染色体上的运动神经元存活基因1(SMN1)突变引起的。95%～98%为SMN1第7、8外显子(E7、E8)缺失,包括E7、E8杂合缺失或仅E7纯合缺失，SMN1点突变比例为2%～5%[3-4]。因此，针对SMN1基因E7和E8的拷贝数检测已成为目前筛查SMA携带者的常用方法。鉴于该病致死率极高，致病基因明确，且人群中携带者频率比较高，2008年美国医学遗传学会就提倡对所有育龄夫妇提供SMA筛查。若夫妻双方均为携带者，可进行产前诊断判断胎儿是否为SMA患儿。本研究采用荧光定量PCR技术对盐城地区孕妇进行SMA携带者筛查，对于高危胎儿，结合多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)进行产前诊断，可以有效阻止SMA患儿的出生，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年10月至2022年2月盐城市妇幼保健院产前诊断中心就诊的33 560例表型正常的孕妇为研究对象。所有孕妇进行SMA携带者筛查的宣教，其中自愿接受SMA携带者筛查4 429例，接受率约13.2%。孕妇年龄18～45岁，平均(27.9±4.7)岁；孕周11～20周，平均(15.5±2.9)周,且否认SMA家族史和生育史。本研究获得医院伦理委员会审查和批准，且接受携带者筛查的孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1基因组DNA提取

参与筛查的孕妇用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周静脉血2 mL,应用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血DNA，测定浓度调整至10～20 ng/μL。参加产前诊断的孕妇采集羊水10mL,应用微量DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取羊水基因组DNA。

1.2.2荧光定量PCR检测

本研究应用SMN1外显子缺失检测试剂盒(上海五色石医学科技有限公司)采用化学阻断法阻断SMN2，对提取到的基因组DNA先进行SMN1基因E7/E8扩增，再对拷贝数进行分析计算。按照试剂盒套组说明书操作：取出试剂盒，将试剂盒平衡至室温，根据当次实验所进行的反应数(标本DNA、1个空白对照、1个缺失对照及3个梯度正常对照)计算并移取相应试剂，按照试剂盒方案配制反应体系，按照以下条件进行PCR扩增，实时收集荧光信号，记录并计算实验结果。

1.2.3MLPA

应用MLPA P460试剂盒(荷兰MRC公司)来验证SMN1的E7和E8拷贝数变异的情况。MLPA P460试剂盒中探针包括SMN1和SMN2基因E7和E8。按操作流程DNA经过变性、探针杂交、连接反应和扩增后，得到的扩增产物通过ABI3500毛细管电泳，所得数据用Coffalyser V8.0软件分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 SMA携带者筛查结果

盐城地区孕产妇的SMA携带频率为1/61，即61例孕妇中有1例SMA携带者。73例携带者接受了遗传咨询，60例配偶(82.2%)接受了SMA筛查，结果显示2对夫妇同时为SMA携带者，见表1。

表1 SMA携带者筛查结果(n)

2.2 产前诊断结果

2例高风险孕妇运用MLPA行产前诊断，最终提示1例胎儿为SMN1基因E7/E8双拷贝，即正常，孕妇继续妊娠；另1例胎儿为SMN1基因E7/E8零拷贝，即SMA患者，孕妇终止妊娠。

3 讨 论

SMA是一种致死性神经系统性疾病，主要表现为对称性肌无力和肌萎缩，患者最终将死于呼吸衰竭和严重的肺部感染。治疗SMA的药物目前只有诺西那生钠、索伐瑞韦和利司扑兰3种。虽然这些药物的上市给SMA患者带来了希望，但价格非常昂贵，普通家庭无法承受。因此，通过携带者筛查和产前诊断技术来避免SMA患儿的出生，是一种经济有效的预防该病的方法。

2007年，美国部分州即开始对新生儿和产前遗传咨询的妇女提供SMA筛查。2017年，美国妇产科学会便倡导对所有计划妊娠或者已经妊娠者进行SMA筛查[5-6]。在中东，以色列于2008年引入SMA筛查，于2013年扩大到全部人口[7-8]。2005—2009年，我国台湾地区有超过10万例孕妇进行了SMA携带者筛查[9]。本研究对33 560例孕妇进行SMA筛查的宣教，其中4 429例孕妇自愿接受SMA筛查，接受率约13.2%。而张菁菁等[10]报道南京地区16 549例孕妇有34.9%进行了筛查。分析盐城地区人群接受程度较低的原因主要与人们对于SMA不了解和经济条件相关。因此，需要加强对孕妇进行SMA筛查知识的宣教，借助政府机构的相关政策的支持，将会提高接受SMA筛查的人群比例。

研究表明，SMA的携带频率为1/60～1/40。本研究通过对盐城地区4 429例孕妇进行SMA携带者筛查,共发现73例为SMA携带者，携带者频率为1/61。据报道，以色列和澳大利亚的携带率分别为1/60和1/50[8,11]，我国上海地区的携带者频率为1/52[12]，云南地区的携带者频率为1/49[13]，本研究与前述报道较一致。此外，虽然SMN1基因E7/E8的缺失突变占SMN1的95%～98%，但当检测阴性时，只能排除SMN1基因E7和E8的缺失突变，不能排除SMN1基因其他区域的点突变，以及一条5号染色体上有2个SMN1基因、另一条5号染色体上的SMN1基因E7和(或)E8缺失[14]。故本地区SMA的携带率应略高于1/61，该项研究为本地区进行此项筛查提供了数据支撑，便于临床医生对孕妇进行宣教和遗传咨询。

SMA属于单基因遗传病，具有亲代向子代传递的特性，对于既往有过SMA患儿生育史的妇女或SMA基因携带者夫妇，其妊娠的胎儿患SMA的风险为25%，应进行SMA的产前诊断。目前，SMA的产前诊断方法主要对绒毛、羊水或脐血等标本运用限制性片段长度PCR、MLPA、荧光定量PCR、变性高效液相色谱和测序等分子生物学技术进行检测。张柳娟等[15]于2016年通过MLPA诊断出3例胎儿均为SMN1 E7和E8杂合缺失。徐晨阳等[16]于2017年对14个SMA家系进行MLPA检测，发现正常胎儿6例，携带者7例，SMA患者3例。本研究73例孕妇携带者中60例配偶接受SMA筛查，2对夫妇同时为SMA携带者，并对2例高风险孕妇采集羊水通过MLPA行产前诊断，最终提示1例胎儿为SMN1基因E7/E8双拷贝(正常)，另1例胎儿为SMN1基因E7/E8零拷贝(SMA患儿)。此外，因为SMN2基因为SMN1调节基因，其拷贝数与SMA的病情严重程度呈反比，所以在检测羊水时都检测了SMN2基因作为参考。本研究中1例胎儿为SMA患者，SMN2基因的E7/E8均为3拷贝，但预测其出生后的临床表型介于Ⅱ型和Ⅲ型之间，仍然非常严重。该夫妇经遗传咨询后选择终止妊娠。

综上所述，鉴于SMA疾病的严重程度、人群的高携带频率和治疗费用昂贵的现状，针对育龄人群的携带者筛查显得尤为重要。在临床工作和科普活动中需要加大对育龄人群的宣教，进行规范化的遗传咨询及必要的生育指导，从而避免SMA患儿的出生，为社会和家庭减轻负担，从而提高出生人口质量。