冬荪绿霉病病原鉴定及药剂筛选

刘忠玄，王万坤，吴 阳，黄 静，王 晶，王 芳，马 丁，康 超*

(1.贵州科学院贵州省生物研究所，贵州贵阳 550025；2.贵州科学院贵州省分析测试院，贵州贵阳 550002；3.铜仁职业技术学院，贵州铜仁 554300)

冬荪(Phallusdongsun)，常寄生于枯竹根部，属于鬼笔目(Phallales)鬼笔科(Phallaceae)鬼笔属(Phallus)[1]，是一种营养丰富、味道鲜美、肉质松脆的食药两用的林下真菌。自然条件下，冬荪单生或簇生于林下腐殖质层中，主要分布于贵州、四川、云南、广东、安徽等地[2-4]。冬荪子实体未开伞前呈球形或卵圆形，俗称菌蕾或菌蛋，半埋土生，灰色至白色，野生菌蛋直径5～7 cm，人工种植菌蛋可达20 cm，基部有白色或浅黄色菌索，后期表面有皱纹，有弹性，待菌蛋硬化成熟后，菌托层由上部裂开开伞，形成白色子实体。冬荪富含邻苯二甲酸二丁酯、多糖、紫苏烯、异山梨醇、麦甾醇、甲基硫醇、氨基酸、糖醛酸聚糖等成分，提取物能抑制腐败菌生长，可开发为短期的生物性防腐剂，子实体、菌柄和菌托具有一定的治风湿、活血祛瘀、镇痛、抗氧化甚至抗癌的药用活性[5-7]，适当的食用可增强免疫力、防病保健[8]，随着食药价值和资源开发利用研发不断突破，冬荪日益成为人们关注的珍稀食用菌焦点。

冬荪是贵州省大方县的地方特色，也是中国国家地理标志产品，更是贵州省最主要林下经济产业之一。2015年前大方县、织金县及周边已种植超过133.33 hm2[9]，至2016年达400 hm2，净产量约60 t。十三五期间，贵州省规划人工种植冬荪约666.67 hm2，产量达5万t[贵州省“十三五”食用菌产业发展规划(2016—2020年)]。近年来，随着贵州省农业产业结构调整以及脱贫攻坚和乡村振兴发展战略，助推食用菌产业迅速发展，冬荪种植规模不断扩大，尤其是国家地理标志产品认证后，冬荪产业在贵州形成裂变式发展，产品数量和质量不断提升，相关的科研成果也不断涌现，但国内外对冬荪的研究集中于资源分类、组织分离、良种选育、栽培技术、农药及重金属残留、生化药理特性等方面[10-12]。冬荪病虫害研究极少，主要是其抗病虫害能力较强，一是冬荪子实体由菌蛋生长破壳形成，自身具备较好的物理防御系统；二是冬荪特殊的气味和分泌物能有效趋避部分病虫害侵染，因此，关于冬荪病虫害的研究极少。

2020和2021年秋季，正直冬荪收获期，笔者所在课题组成员分别从贵州省毕节市大方、织金2个县采集65份冬荪菌蛋绿霉病样本，并对5个种植基地(约20 hm2)进行初步调查，其发病率达9%，发病程度为轻度。经鉴定为绒毛木霉(T.tomentosum)引起的冬荪新病害，严重制约当地冬荪产业高质量发展，急需阐明该病害的病原学并提出科学的防控方案。然而，截至2020年末，中国农药信息网(http：//www.chinapesticide.org.cn/)登记的食用菌可用农药产品13个、有效成分6种，3种类型(植物生长调节剂、杀菌剂、杀虫剂)，仅咪鲜胺锰盐为杀菌剂[13]，但均未提及冬荪病害，关于该病害的防治仍是空白，防治药剂急需筛选论证。因此，明确冬荪绿霉病病原种类、筛选具有针对性的高效杀菌剂并进行药剂混配试验，选出共毒系数较高的混配方案为生产实践提供理论参考，对当地冬荪绿霉病的防控和延缓病原抗药性具有十分重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料2020和2021年秋季，从贵州省毕节市大方县、织金县采集冬荪绿霉病菌蛋共65份，用无菌袋密封包装带回实验室进行病害诊断、病原分离。

4种杀菌剂原药分别为95%咪鲜胺锰盐(常州天择化工有限公司)、96%吡唑醚菌酯(湖北康宝泰精细化工有限公司)、96%苯醚甲环唑(常熟恒耀新材料有限公司)、95%唑菌酯(沈阳化工研究院有限公司)。

1.2 冬荪绿霉病病原菌分离培养组织分离法：选择轻、中度感病菌蛋样品，以75%无水乙醇消毒10 s，再用1% NaClO消毒1 min，无菌水冲洗3次并用无菌滤纸吸干水分，切取病健交界处组织块(0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm)于PDA培养基中25 ℃黑暗培养3 d，挑取纯净的菌丝进一步纯化，分离物保存于4 ℃的PDA斜面。

菌丝分离法：在超净工作台中用无菌针挑取中、重度感病菌蛋样品表面病原菌菌丝尖端，置于PDA培养基中25 ℃黑暗培养3 d，进一步纯化得到纯分离物保存于4 ℃的PDA斜面。

观察记录PDA培养基上病原菌落形态、培养特征，显微镜下观察分生孢子、产孢结构形态和大小并拍照。

1.3 病原物致病性验证2021年10月，在大方县2个冬荪基地(105°41′45″E，27°10′16″N)，采用注射法将孢子悬浮液(106conidia/mL)接种至无症状的冬荪菌蛋(直径8～12 cm)表皮层，每个菌蛋2个接种点，各50 μL，从分离纯化获得培养特征相似的菌株15株中随机选择3个代表菌株(GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103)进行接种，各10个重复，以10个无菌水接种为对照。

1.4 病原物分子鉴定参照擎科生物提供试剂盒[T5Direct PCR Kit(TSE011)(TsingKe，Beijing，China)]说明提取病原DNA，并参照各引物特性进行PCR扩增。3个致病代表菌株GZDS1101、GZDS1102、GZDS1103的ITS、tef1、rpb2基因片段分别采用引物：(ITS)ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，(ITS)ITS4(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′)；(tef1)EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)，(tef1)TEF1LLErev(5′-AACTTGCAGGCAATGTGG-3′)[14]；(rpb2)fRPB2-5F(5′-GGAGGATACTTCATCATCAATGG-3′)，(rpb2)fRPB2-7cR(5′-CCCATGGCTTGCTTGCCCAT-3′)[15]。

PCR反应体系(50 μL)，DNA模板1 μL，引物1 μL，2 × T5Direct PCR Mix 25 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件：94 ℃预热5 min，94 ℃变性30 s，55～60 ℃(各引物不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃补平10 min，40个循环。PCR产物电泳检测并纯化后送至擎科生物上海分公司进行测序并用Chromas软件分析序列，上传至NCBI数据库，通过BLAST同源比对，采用MEGA 5.0构建系统发育树。

1.5 防治药剂筛选采用菌丝生长速率法筛选药剂[16]。以GZDS1101为供试病原菌，将4种原药配制成母液再稀释至少5个浓度梯度，按体积1∶9加入PDA并制成平板，取直径5 mm菌饼接种于5个浓度的PDA带毒平板中心，等量无菌水代替农药作为对照，重复3次，28 ℃培养2～3 d后采用十字交叉法测量菌落直径，运用DPS 13.0系统计算各药剂对绒毛木霉菌丝生长抑制回归方程和EC50。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100%

将咪鲜胺锰和苯醚甲环唑进行组合配比，按质量浓度8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8混合并稀释至试验浓度进行测试，以单剂作为对照，以无菌水替代为空白对照，各重复3次，求得各配比的毒力回归方程和EC50，再根据共毒系数法求得独立指数、理论毒力指数、实际毒力指数和混合剂的共毒系数CTC，CTC>120为增效作用，80

实测药剂毒力指数(ATI)=标准药剂的EC50/供试药剂的EC50×100%

混剂理论毒力指数(TTI)=(药剂A毒力指数×Ax)+(药剂B毒力指数×Bx)(Ax、Bx为药剂A、B在混剂中的百分比)

共毒系数(CTC)=ATI/TTI×100%

2 结果与分析

2.1 冬荪绿霉病病害症状该病害发生于冬荪菌蛋上，成熟子实体未见发生。病害的早期，菌蛋表面出现不规则的、褐色至黑色斑点，呈水渍状，病斑不断扩大，2～3 d后产生白霉状物(病原的菌丝体)，菌蛋表皮出现腐烂症状并软化，灰白色的表皮变为明显水渍状，开裂，内部肉质层裸露，软腐的表皮褶皱状塌陷，白色菌丝转色为绿色粉状霉层(图1b、c、d)，嗅之有闷人的芳香，无恶臭味，很快全蛋腐烂、干瘪，中重度感病菌蛋将无法发育为成熟的子实体，影响冬荪产量和质量，严重时甚至绝收。

2.2 致病性测定结果3个菌株接种3 d后，处理组均观察到白霉状菌丝，明显的表皮软腐症状与野外发病症状相一致，7 d后出现浅绿色菌落(图1 h)，对照组无感病症状，再分离发病组病原与接种病原形态特征一致，完成柯赫氏法则验证。

2.3 冬荪绿霉病病原形态鉴定结果3个致病菌株在PDA平板上生长迅速，菌丝稀疏棉絮状，白色，中心浅黄色，背面浅灰黄色；菌丝无隔；分生孢子梗从菌丝交错生出，直立单生，具有明显的颈部，多数向上弯曲，长(4.0-)4.2～5.6(-5.9)μm，最宽(2.9-)3.1～3.8(-4.3)μm，底部宽(1.7-)2.1～2.7(-3.1)μm(n=50，图1f)；分生孢子光滑、宽椭圆形，大小为(2.7-)3～3.3(-3.6)× 2.2～2.7 μm(n=50，图1g)，病原形态特征与绒毛木霉T.tomentosum一致[17-19]。

注：a.无症状的冬荪子实体和菌蛋，b、c、d.感病菌蛋软腐、绿霉和开裂症状，e.绒毛木霉在PDA平板生长5 d后菌落正面和背面，f.分生孢子梗结构，g.分生孢子，h.病原GZDS1101接种7 d后发病症状。Note：a.Asymptomatic mature fruit body and immature “egg” of stinkhorn,b，c，d.Symptoms of rot，green mold and cracking on immature “egg”，respectively，e.T.tomentosum on PDA medium 5 days(front and back)，f.Conidiophore，g.Conidia，h.Symptoms at seven days after inoculation，pathogenic bacteria GZDS1101 in the treatment(GZDS1101).图1 冬荪绿霉病Fig.1 Green mold of P.dongsun

2.4 冬荪绿霉病病原分子鉴定结果根据NCBI-BLAST和系统发育树分析，3个菌株为同种，ITS基因与T.tomentosum(KX343119.1、KX343120.1、KX343120.1等)、T.cerinum(KP009282.1、KP009288.1)2个种同源性>98%，与其他种同源性<97%(图2)，初步确认为木霉属Trichoderma；tef1和rpb2基因与T.tomentosum(CBS 120637，S23，S33，等;图3、图4)同源性均为99%～100%，与其他种<96%，种水平将3株病原鉴定为绒毛木霉T.tomentosum[14]。

图2 基于rDNA-ITS序列的病原菌系统发育进化树Fig.2 The phylogenetic tree of pathogens based on rDNA-ITS sequence

图3 基于tef1序列的病原菌系统发育进化树Fig.3 The phylogenetic tree of pathogens based on tef1 sequence

图4 基于rpb2序列的病原菌系统发育进化树Fig.4 The phylogenetic tree of pathogens based on rpb2 sequence

2.5 防治冬荪绿霉病药剂筛选结果4种供试药剂对病原菌生长均有一定的抑制效果，但敏感性存在显著差异(表1)。苯醚甲环唑抑菌作用最强，EC50为1.93 mg/L；其次是吡唑醚菌酯，EC50为4.02 mg/L，咪鲜胺锰盐EC50为4.96 mg/L，而唑菌酯敏感性较低，EC50为23.89 mg/L。

表1 不同杀菌剂对病原菌丝生长抑制情况

选用咪鲜胺锰盐(食用菌合法登记)与敏感性最强的苯醚甲环唑进行混配试验，结果显示不同比例混配抑菌效果差异显著。咪鲜胺锰盐与苯醚甲环唑的质量比为1∶2时CTC>120，为150.88，表现增效作用，增效显著。质量比为1∶1和1∶4 时，CTC值分别为104.25和117.56，为相加作用，其他混配质量比的CTC值均<80，在试验中表现一定的拮抗作用(表2)。

表2 咪鲜胺锰盐与苯醚甲环唑混配抑菌效果

3 讨论

该研究对采自贵州省大方和织金2县的冬荪绿霉病进行病原分离、致病性测定及鉴定发现，病原菌株具有较强的致病性，经形态和多基因分子生物学鉴定为绒毛木霉T.tomentosum。采用菌丝生长速率法测定4种杀菌剂原药对病原菌的毒力，结果表明，病原菌对4种药剂均有一定的敏感性，其中苯醚甲环唑抑菌作用最强，EC50为1.93 mg/L；其次是吡唑醚菌酯和咪鲜胺锰盐也较敏感，EC50分别为4.02和4.96 mg/L，而唑菌酯敏感性相对较低，EC50为23.89 mg/L。咪鲜胺锰盐与苯醚甲环唑混质量比为1∶2时，EC50为2.18 mg/L，CTC值为150.88，大于120，表现增效作用，在该试验中抑菌效果最强，质量比为1∶1和1∶4时，为相加作用，其他混配质量比表现一定的拮抗作用。

目前，关于冬荪的研究主要在中国，并集中在种源选育、栽培技术和产品加工等方面，关于病害的研究极少，随着贵州地区规模化种植及食用菌连作障碍的影响，冬荪病害日益严重，该研究的冬荪绿霉病一般在低海拔(800 m以下)区域的高温天气(28 ℃以上)大发生，传播速度较快，具有较强的传染性，尤其是蚊虫叮咬或受伤的冬荪菌蛋上发病率更高，伤口有助于病原菌入侵定殖，该病害已成为制约该地区冬荪产业发展的重要因素之一，该研究鉴定冬荪绿霉病病原为绒毛木霉，该菌在有益和有害菌方面均少有记载，急需科学的防控策略和方法。

在药剂筛选试验中，仅咪鲜胺锰盐为已登记的食用菌可用药，在供试药剂中单剂药效中等；而苯醚甲环唑单剂作用效果最佳，将二者进行混配测试，结果显示二者并不是简单的相加增效作用，当咪：苯为1∶2时增效最显著，不合适的混配甚至出现一定的拮抗作用，通过药剂混配，不仅能提升协同增效杀菌谱，还能延缓病原菌抗药性产生，提升药剂适用期限。药剂筛选结果表明，4种供试药剂对病原菌均有较强的抑制作用，该结果可为冬荪绿霉病的田间药剂防治提供一定的理论依据。