ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭的作用及其机制

刘光霞，陈芳，卢亚敏，牛丽霞，侯瞻，赵连春*

1河北省人民医院核医学科，河北 石家庄 050051；2河北以岭医院检验科，河北 石家庄 050091

甲状腺肿瘤为常见的头颈部肿瘤和内分泌肿瘤[1]。甲状腺癌根据组织学特征可分为分化型和未分化型，其中分化型甲状腺癌约占75%，又可分为乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)和滤泡状甲状腺癌(follictalar thyroid carcinoma，FTC)[2-7]。ZCCHC12(含CCHC结构域的锌指蛋白12)是骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路中的转录共激活因子[8-10]。本课题组前期研究发现，ZCCHC12在甲状腺癌组织和细胞系中呈过表达，且可能通过BMP/SMAD信号通路促进甲状腺癌的发生和发展[11]。另有研究发现，ZCCHC12可激活环磷腺苷效应元件结合蛋白(cyclic AMP-response element binding protein，CREB)[12]，而CREB可促进人脐动脉平滑肌细胞中p21的表达[13]，p21上调对甲状腺癌的发生发展具有抑制作用[14]。截至目前，关于ZCCHC12调控CREB/p21信号通路对分化型甲状腺癌的影响鲜少报道。本研究探讨了ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人甲状腺滤泡上皮细胞HUM-CELL-0097、人PTC细胞TPC-1由河北省人民医院实验室保存；人FTC细胞FTC-133购自英国HHPACC细胞库。ZCCHC12、CREB、p21、E-cadherin、N-cadherin、GAPDH兔单抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司；BCA试剂盒购自美国Pierce公司；CREB ELISA试剂盒购自美国Raybiotech公司；p21 ELISA试剂盒购自美国Proteintech公司；空质粒pcDNA.3.1购自美国Invitrogen公司。高速离心机、移液器购自德国Eppendoff公司；电泳仪购自英国Syngene公司；蛋白凝胶成像系统、PCR仪、iMark酶标仪购自美国Bio-Rad公司；超净工作台购自北京医疗设备厂；细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 研究对象 选取2017年5月－2018年12月河北省人民医院收治的50例分化型甲状腺癌者(设为分化型甲状腺癌组)，其中男29例，女21例，年龄42～68(53.5±2.6)岁，PTC 30例，FTC 20例。纳入标准：(1)经病理学检查确诊为分化型甲状腺癌；(2)临床资料完整。排除标准：(1)伴有其他系统恶性肿瘤；(2)合并心脑血管、造血系统、肝、肾等疾病；(3)伴有严重感染性疾病、免疫系统疾病；(4)伴有意识障碍或精神疾病；(5)正接受其他研究。另选取该院同期50名健康体检者作为健康对照组。本研究经河北省人民医院伦理委员会批准(批准文号：K-2018-037)，所有研究对象均签署知情同意书。

1.3 ELISA法检测血清CREB、p21含量 抽取研究对象的空腹静脉血3 ml，3500 r/min离心10 min，分离血清。按照CREB、p21 ELISA试剂盒说明书步骤操作，采用iMark酶标仪检测450 nm波长处的光密度(OD)值，计算血清CREB、p21含量。

1.4 细胞培养及pcDNA.3.1-CREB过表达载体的构建 HUM-CELL-0097、TPC-1与FTC-133细胞分别于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和青霉素的DMEM培养基中培养。采用Trizol法提取细胞总RNA，以RNA为模板反转录成cDNA，然后扩增CREB基因序列(GenBank accession number AY347527，包括酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ)。将扩增获得的片段酶切后与空质粒pcDNA.3.1连接并测序，将正确的质粒命名为pcDNA.3.1-CREB。

1.5 细胞转染 将TPC-1细胞和FTC-133细胞分别接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育24 h，待细胞融合至70%时，按照转染试剂操作说明进行细胞转染。设置空白对照组(正常培养TPC-1或FTC-133细胞)、NC si组(转染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si组(转染ZCCHC12siRNA)、ZCCHC12 si+NC si组(转染ZCCHC12siRNA后，转染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si+NC pc组(转染ZCCHC12siRNA后，转染pcDNA.3.1)、ZCCHC12 si+CREB pc组(转染ZCCHC12siRNA后，转染pcDNA.3.1-CREB)、ZCCHC12 si+p21 si组(转染ZCCHC12siRNA后，转染p21 siRNA)。将ZCCHC12 siRNA、p21 siRNA、non-specific siRNA、pcDNA.3.1-CREB和pcDNA.3.1各0.3 μg分别与0.6 μl Turbofect混匀，加入各组细胞中，37 ℃、5% CO2孵育24 h，采用Western blotting检测转染效率。

1.6 Western blotting检测ZCCHC12、CREB、p21、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量 采用Western blotting检测HUM-CELL-009、TPC-1与FTC-133细胞中CREB、p21蛋白表达量；空白对照组、NC si组(转染non-specific siRNA)、ZCCHC12 si组、ZCCHC12 si+NC si组、ZCCHC12 si+NC pc组、ZCCHC12 si+CREB pc组CREB、p21蛋白表达量；ZCCHC12 si组、ZCCHC12 si+NC si组、ZCCHC12 si+p21 si组p21、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量。各组加入预冷的RIPA蛋白抽提试剂，离心后取上清。利用BCA试剂盒定量蛋白。上样，行SDS-PAGE电泳，然后转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；加入人源ZCCHC12单抗(1:800)、CREB单抗(1:800)、p21单抗(1:600)、E-cadherin单抗(1:600)、N-cadherin单抗(1:700)和GAPDH兔单抗(1:1000)4 ℃孵育过夜；TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记的羊源二抗室温孵育1 h；TBST清洗，X线曝光，采用Image-ProPlus软件分析。以GAPDH为内参，目的蛋白条带与GADPH条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力 设置空白对照组、ZCCHC12 si组、NC si组、ZCCHC12 si+NC si组和ZCCHC12 si+p21 si组，各组处理方法同1.5，利用Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell上层小室中加入细胞悬液，下层小室加入含5%胎牛血清及0.5%小牛血清的培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h后，擦去凝胶和滤膜上表面细胞，经苏木精染色后进行细胞计数。

1.8 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni检验。P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 分化型甲状腺癌患者血清及细胞系中CREB、p21含量 与健康对照组比较，分化型甲状腺癌组血清CREB含量明显升高(P＆lt;0.05)，p21含量明显降低(P＆lt;0.01)(图1A)。与HUM-CELL-0097细胞比较，TPC-1、FTC-133细胞中CREB蛋白相对表达量明显升高，p21蛋白相对表达量明显降低(P＆lt;0.01，图1B)。

图1 分化型甲状腺癌患者血清(n=50)及细胞系(n=3)中CREB、p21含量Fig.1 Contents of CREB and p21 in serum of patients (n=50) with differentiated thyroid cancer and cell line (n=3)

2.2 干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化及侵袭能力的影响 ZCCHC12 si组TPC-1或FTC-133细胞中ZCCHC12蛋白相对表达量较NC si组明显降低(P＆lt;0.01)，表明ZCCHC12干扰实验成功(图2A)。ZCCHC12 si组TPC-1或FTC-133细胞中E-cadherin蛋白相对表达量明显高于空白对照组和NC si组，N-cadherin蛋白相对表达量明显低于空白对照组和NC si组，细胞迁移数明显少于空白对照组和NC si组(P＆lt;0.01，图2)。

图2 干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力的影响Fig.2 Influence of ZCCHC12 interference on epithelial-mesenchymal transition and invasion of differentiated thyroid cancer cells

2.3 干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞中CREB、p21蛋白表达的影响 与空白对照组比较，ZCCHC12 si组TPC-1或FTC-133细胞中CREB蛋白相对表达量明显低于空白对照组和NC si组，p21蛋白相对表达量明显高于空白对照组和NC si组(P＆lt;0.01，图3)。

图3 干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞中CREB、p21蛋白表达的影响(Western blotting, n=3)Fig.3 Influence of ZCCHC12 interference on the protein expressions of CREB and p21 in differentiated thyroid cancer cells(Western blotting, n=3)

2.4 干扰ZCCHC12且过表达CREB对分化型甲状腺癌细胞中p21蛋白表达的影响 ZCCHC12 si+CREB pc组TPC-1或FTC-133细胞中CREB蛋白相对表达量明显高于ZCCHC12 si+NC pc组和ZCCHC12 si组(P＆lt;0.01)，表明细胞转染实验成功。ZCCHC12 si+CREB pc组TPC-1或FTC-133细胞中p21蛋白相对表达量明显低于ZCCHC12 si组和ZCCHC12 si+NC pc组(P＆lt;0.01，图4)。

图4 干扰ZCCHC12且过表达CREB对分化型甲状腺癌细胞中p21蛋白表达的影响( Western blotting, n=3)Fig.4 Influence of ZCCHC12 interference and CREB overexpression on the protein expression of p21 in differentiated thyroid cancer cells (Western blotting, n=3)

2.5 干扰ZCCHC12和p21对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化及侵袭能力的影响 ZCCHC12 si+p21 si组TPC-1或FTC-133细胞中p21蛋白相对表达量明显低于ZCCHC12 si+NC si组和ZCCHC12 si组(P＆lt;0.01)，表明细胞转染成功(图5A)。ZCCHC12 si+p21 si组TPC-1或FTC-133细胞中E-cadherin蛋白相对表达量明显低于ZCCHC12 si组和ZCCHC12 si+NC si组，N-cadherin蛋白相对表达量明显高于ZCCHC12 si组和ZCCHC12 si+NC si组，细胞迁移数明显多于ZCCHC12 si组和ZCCHC12 si+NC si组(P＆lt;0.01)(图5)。

图5 干扰ZCCHC12和p21对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力的影响Fig.5 Influence of interference of ZCCHC12 and p21 on epithelial-mesenchymal transition and invasion of differentiated thyroid cancer cells

3 讨 论

既往研究发现，ZCCHC12在甲状腺癌组织中呈高表达[11]。ZCCHC12高表达可明显促进甲状腺癌细胞CGTH W-3和FTC-133增殖并抑制其凋亡，干扰ZCCHC12则可明显抑制CGTH W-3和FTC-133细胞增殖并促进其凋亡，表明ZCCHC12对甲状腺癌细胞增殖和凋亡起调控作用[11]。另有研究发现，ZCCHC12可明显促进神经细胞中CREB的表达[8]，而CREB可抑制小鼠胰岛β细胞中p21的表达[15]。Ruan等[16]发现，p21高表达可有效抑制甲状腺癌的发展。截至目前，ZCCHC12通过CREB/p21通路调控分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力相关的研究鲜见。因此，本研究探讨了ZCCHC12、CREB和p21在分化型甲状腺癌细胞中的调控关系，以及对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭能力的影响，结果显示，干扰ZCCHC12可上调E-cadherin表达、下调N-cadherin表达，表明干扰ZCCHC12可明显抑制分化型甲状腺癌细胞的上皮-间质转化；Transwell实验结果显示，干扰ZCCHC12可明显抑制分化型甲状腺癌细胞的侵袭能力。

Ayroldi等[17]研究发现，CREB在甲状腺癌的发展中起着重要作用，可促进肿瘤的生长。Li等[12]发现，ZCCHC12可上调宫颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞和脑胶质瘤细胞中CREB的表达。然而，ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞中CREB的调控作用尚未明确。本研究结果显示，分化型甲状腺癌患者血清中CREB含量明显升高，而抑制分化型甲状腺癌细胞中ZCCHC12的表达后，CREB蛋白表达量明显下降。由此可见，在分化型甲状腺癌中，ZCCHC12可促进CREB的表达，与Li等[12]报道的宫颈癌细胞、神经母细胞瘤细胞和脑胶质瘤细胞中ZCCHC12对CREB的正向调节作用一致。p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白，作为G1/S期限制点的调节因子，可抑制细胞从G1期向S期转化，起到抑制细胞生长的作用[18-20]。Li等[21]研究发现，p21过表达可有效抑制甲状腺癌细胞的增殖。Yang等[22]研究发现，p21可促进甲状腺间变性癌细胞凋亡。有研究发现，干扰lncRNA-HOTAIR可上调p21的表达，从而抑制结直肠癌细胞的侵袭能力[23]。截至目前，p21对分化型甲状腺癌细胞侵袭能力的调节作用尚不清楚。本研究结果显示，分化型甲状腺癌患者血清中p21含量明显降低。在分化型甲状腺癌细胞中，干扰ZCCHC12可明显上调p21蛋白的相对表达量，而过表达CREB可明显消除干扰ZCCHC12对p21表达的促进作用，提示在分化型甲状腺癌细胞中，干扰ZCCHC12可通过CREB促进p21的表达。此外，与干扰ZCCHC12的细胞比较，同时干扰ZCCHC12和p21可明显下调E-cadherin蛋白的表达、上调N-cadherin蛋白的表达，表明干扰p21可有效消除干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞上皮-间质转化的影响。Transwell实验结果也表明，干扰p21可有效消除干扰ZCCHC12对分化型甲状腺癌细胞侵袭能力的影响。因此，在分化型甲状腺癌细胞中，干扰ZCCHC12可通过CREB增强p21的表达，进而抑制分化型甲状腺癌细胞的上皮-间质转化和侵袭。有研究发现，ZCCHC9可通过与NF-kB启动子结合抑制MAPK通路[24]，而MAPK通路可激活Notch通路，影响甲状腺乳头状癌细胞的增殖[25]。截至目前，ZCCHC12通过调控MAPK通路影响分化型甲状腺癌细胞增殖的报道较少，后期可探讨ZCCHC12/MAPK在分化型甲状腺癌细胞增殖中的作用。

综上所述，分化型甲状腺癌患者血清中CREB含量明显升高，p21含量明显降低，干扰分化型甲状腺癌细胞中的ZCCHC12可通过抑制CREB的表达而促进p21的表达，进而抑制分化型甲状腺癌细胞的上皮-间质转化和侵袭。但本研究未在体内探讨ZCCHC12、CREB、p21对分化型甲状腺癌发生发展的作用，后续需进一步进行大鼠体内实验探讨ZCCHC12、CREB、p21对分化型甲状腺癌发生发展的影响。