大孔树脂吸附银杏叶萜类内酯的使用寿命及强化再生的研究

陶娟娟，胡佑彪，王 玉，郑元涛，石炳光，陈志元

（劲牌持正堂药业有限公司，湖北 黄石 435000）

0 引言

银杏叶又称公孙树，是银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.） 的干燥叶，采收季节为秋季叶片呈叶绿时，并及时干燥[1-2]。药理研究表明，银杏叶中的有效成分具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂等功效[3-5]。银杏内酯中的A，B，C 等均是二萜类内酯，白果内酯属于半萜类内酯，为银杏中特有成分，是一种良好的血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF） 拮抗剂[6]。

大孔树脂大多是一种以芳香基化合物为原料，通过工业方法合成的多孔骨架结构，其具有稳定性强、吸附效率高、纯化效果好等优点[7-8]。目前，大孔树脂普遍应用于天然产物的分离、纯化生产上。大孔树脂在工业应用过程中会遇到诸多问题，如树脂老化、树脂再生困难、树脂单体残留对终产物二次污染等[7]。近年来，国内对树脂性能的研究较多，主要集中于树脂种类选择、吸附效率对比、分离纯化参数优化、终产物中树脂残留物检测分析等方面[6，9-10]。然而，在实际生产过程中树脂使用寿命及再生方式对于生产成本和资源利用影响较大。课题组未见大孔树脂吸附银杏叶萜类内酯的使用寿命及强化再生的研究。因此，课题组以D101 型大孔树脂吸附银杏叶萜类内酯的工艺优化为前提，进一步对D101 型大孔吸附树脂吸附银杏叶萜类内酯的使用寿命及强化再生工艺进行深层次研究，从而为D101 型大孔吸附树脂纯化银杏叶萜类内酯的工业化生产提供数据支持。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，配有蒸发光散射检测器；电子天平（万分之一电子天平、十万分之一电子天平）；纯水/超纯水一体系统，默克密理博公司产品；5 cm×50 cm 的玻璃柱（用于装填大孔树脂）。

银杏叶，购自湖北省药材公司，在湖北省中药配方颗粒工程中心技术研究中心鉴定，为银杏科植物银杏的干燥叶；大孔吸附树脂（D101 型食品级），天津市海光化工有限公司提供；银杏叶总内酯对照提取物（供含量测定用，批号为610017-201501，中国食品药品检定研究院提供；甲醇、盐酸、乙酸乙酯、醋酸钠，均为分析纯；正丙醇、四氢呋喃，均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 银杏叶提取液制备

称取切碎后的银杏叶药材1.0 kg，使用8 倍（M/V） 60%（V/V） 乙醇回流提取3 次，每次提取1 h，合并3 次提取液，200 目滤袋滤过后浓缩至膏状，加入纯水溶散后过D101 型大孔树脂柱，纯水洗柱后，分别用体积分数为30%和60%乙醇溶液进行梯度洗脱，回收60%乙醇洗脱液，采用减压浓缩至膏状，真空干燥，最后用3 倍体积乙酸乙酯、4 倍体积丙酮分别洗脱树脂，回收乙酸乙酯洗脱液，加一定量的水溶液溶散，用等比例的环己烷提取3 次，水液减压浓缩得溶液A。回收丙酮洗脱液，加一定量的水溶液溶散，静置过滤，上聚酰胺（200 目） 柱，用等比例水洗脱3 次，4 倍（M/V） 70%乙醇洗脱4 次，收集洗脱液后，与A 兼并，真空干燥，即得银杏总内酯[11]。

2.2 溶液配置

2.2.1 银杏叶提取液制备

称取银杏叶提取物150 mg（精密称定），加10 mL水温热溶散，用20 mL 乙酸乙酯旋转提取2 次，回收乙酸乙酯提取液，用甲醇转移至10 mL 容量瓶中并定容。充分摇匀后过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液制备方法

精密称取银杏叶总内酯对照提取物，加甲醇定容，充分摇匀后过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶（如Waters T3色谱柱4.6×250 mm，5 μm）；流动相：正丙醇∶四氢呋喃∶水（1∶15∶84） 等度洗脱；流速1.0 mL/min；检测仪器：蒸发光散射检测器检测[9]，漂移管温度100 ℃，气流量2.5 L/min，柱温30 ℃。

2.2.4 含量测定

精密称取银杏叶总内酯对照提取物适量，加甲醇定容，充分摇匀后过滤，取续滤液。

2.2.5 结果计算

分别以萜类内酯4 种对照品出峰时间定性，以各对照品浓度的对数为横坐标，各色谱峰面积的对数为纵坐标建立4 种成分标准曲线，将样品中相应色谱峰面积带入标准曲线中即可得出供试品中各成分的浓度，并计算4 种内酯成分的总量。产品按干燥品计算，含萜类内酯以银杏内酯A（C20H24O9），银杏内酯B（C20H24O10），银杏内酯C（C20H24O11） 和白果内酯（C75H18O8） 的总量计，不低于0.25%。

试样中4 种萜类内酯的含量分别按下列公式计算，再将4 种萜类内酯含量相加即得到样品中萜类内酯总含量。

式中：X——试样中各萜类内酯的含量，%；

C——供试品中各萜类内酯的质量浓度，mg/L；M——供试品取样量，g。

2.3 大孔树脂吸附银杏叶萜类内酯使用寿命考查

D101 型大孔树脂再生工艺：第1 步，用95%乙醇浸泡4～6 h；第2 步，用1 倍树脂量的95%乙醇冲洗树脂；第3 步，用5 倍树脂量的纯化水洗至无醇味；第4 步，等量称取3 份处理好的树脂，使用真空机抽滤树脂内多余的水分，使树脂干质量约600 g；第5 步，分别装入3 根同体积树脂柱中；第6 步，采取最佳生产工艺取4 800 mL 银杏叶提取液，离心澄清后上树脂柱，上样吸附11.5 h，然后以滴速为500 mL/min 进行洗脱；第7 步，用4～5 倍柱体积的纯水冲洗树脂内的料液澄清透明、无醇味，完成以上洗脱步骤。累计生产54 次吸附，合并洗脱液进行定容，测萜类内脂的含量，统计比吸附量，计算公式如下。

以吸附次数为横坐标，比吸附量为纵坐标，做出吸附能力变化趋势图。

吸附能力变化趋势见图1。

从图1 可知，第1 次生产的树脂比吸附量约98%，随着树脂吸附量的累计增加，树脂吸附能力出现衰退现象，在生产35 次后，吸附能力较稳定，生产到54 次比吸附量为70.23%，说明树脂生产54 次后出现性能下降。

图1 吸附能力变化趋势

2.4 大孔树脂强化再生方法考查

取“2.2”项下生产54 次的树脂验证，分别均分装柱，按照下列3 种工艺进行再生优化，再生后加入银杏叶提取液吸附，计算比吸附量。

3 种再生处理方法的比较见表1。

从表1 可知，随着生产批次的累加树脂经强化再生优化后，树脂吸附性能可恢复至树脂初期状态，结合树脂实际生产用量、操作便捷性等因素考虑，故最优的再生工艺为：第1 步，使用4% NaOH 浸泡4 h，纯水清洗至中性；第2 步，配置4% HCl 溶液浸泡树脂4 h，纯水洗至pH 值中性；第3 步，用2 倍柱体积95%乙醇顶淋冲柱；第4 步，使用蒸馏水洗至pH 值7，再投入使用。

表1 3 种再生处理方法的比较

3 结论

大孔树脂寿命和再生工艺作为天然药物中有效分离工艺的一种处理方式。按照国家食品药品监督管理局发布的规定，吸附同一品种产物的树脂，当树脂解析率下降至30%以上时，不适宜再生产使用。当树脂吸附量逐渐增大后洗脱能力出现衰退，或树脂再生方式不佳时，均采用强化再生工艺优化，常规生产按树脂再生方法进行优化，定期可进行酸碱酸工艺优化。受树脂性能衰退影响产品质量，故建立完善的树脂再生合格指标是树脂再生效果的关键依据，证明树脂经批量生产吸附后的纯化效果与新树脂吸附效果无较大差异。将产品有效成分、吸附率、比吸附量等指标作为树脂再生合格的评价指标，并对D101 型大孔树脂吸附银杏叶萜类内脂的吸附量进行试验验证，认为树脂采用再生工艺后的吸附能力可恢复至树脂初期吸附性能。为中试生产验证提供有利的数据支撑。

在大孔树脂上样吸附、乙醇洗脱工艺前，在上柱前用银杏叶提取液处理后的静置液、经过滤再处理、除去一定量不溶性杂质，可有效缓解树脂柱被杂质堵塞情况，从而延长树脂生产周期，若发生料液上柱堵塞，常用方法是从树脂柱底部连接压缩空气吹散，并使用反冲水反冲洗，洗漂后呈微小颗粒和漂浮的杂质后，可正常生产运行。