基于LC-MS/MS技术研究稻草替代部分玉米青贮对奶牛血浆代谢产物的影响

李娅楠，冶文兴，朱相德，陈 林，徐晓锋，张力莉

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

我国是世界上最大的水稻种植国家[1]，稻草作为我国主要的农作物秸秆来源之一，是不可忽视的可再生资源[2]。稻草最具环保性的资源化利用方式之一是作为动物的粗饲料，但因稻草粗纤维含量高，蛋白质含量低，消化利用率低[3]，从而限制了其在养殖中的广泛应用。反刍动物瘤胃内进行着一系列以微生物为主导的消化代谢反应，瘤胃也是目前自然界公认的木质纤维素高效降解和利用的天然反应器，其真菌和细菌可分泌多种木质纤维素降解酶，复杂多样的微生物能够利用饲料中的纤维类物质，提高饲料的利用率[4]。研究表明，单独饲喂稻草无法提供充足的营养，但稻草可以作为替代饲料配合其他优质饲料用于反刍动物的日粮中[5]，在节约成本的同时也能提高对稻草资源的利用。

代谢物作为代谢的终端产物，能够更加直观地反映出生物的代谢状态，有助于了解代谢紊乱背后机制，代谢组学已经被证明是表征代谢物动态变化的有效手段[6-8]，广泛应用于生物学、医学、药学、农学、食品等领域[9]。血液作为机体重要的媒介液体，含有很多由机体代谢产生并联系不同器官组织的代谢产物[10]，具有重要研究意义。目前，关于日粮改变对奶牛的影响的研究主要集中在对生产性能、瘤胃降解率、消化利用率等指标的测定[11-12]，使用代谢组学方法探究日粮改变对奶牛代谢产物的影响的研究相对较少。因此，本试验采用LC-MS/MS技术分析稻草替代部分玉米青贮后奶牛血浆代谢产物的变化，旨在探讨稻草替代部分玉米青贮作为饲料组成对奶牛血浆代谢产物的影响，为稻草资源在奶牛日粮中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与管理

试验采用随机区组设计方法，选取8头体况良好，体重[(550±10)kg]、胎次[(2.64±0.70)胎]、产奶量[(24.1±3.9) kg·d-1]相近的泌乳后期中国荷斯坦奶牛，随机分为2组，每组4个重复，每个重复1头。对照组(CS)粗饲料由苜蓿青贮、苜蓿、全株玉米青贮组成；试验组(RSc)粗饲料由稻草替代1/3的全株玉米青贮，其他同试验组。日粮组成及营养水平见表1。采用全混合日粮(TMR)饲喂，自由饮水。试验期共35 d，其中预试期14 d，正试期21 d。

表1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础)

1.2 试验仪器与试剂

质谱仪(Thermo Fisher，Q ExactiveTM HF)；色谱仪(Thermo Fisher，Vanquish UHPLC)，C18色谱柱(Thermo Fisher，Hypesil Gold column，100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；低温离心机(Scilogex，D3024R)；甲醇、甲酸、醋酸铵(LC-MS Grade，Thermo Fisher)；水(LC-MS Grade，Merck)。

1.3 血液采集及预处理

于试验第35天晨饲前尾静脉采血，将血液样本收集至含肝素钠抗凝的真空采血管中，以3 000×g、4 ℃离心15 min分离得到血浆。取血浆100 μL置于EP管中，加入400 μL质谱级甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡，冰浴静置5 min，15 000×g、4 ℃离心10 min，取一定量(425 μL)的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中15 000×g、4 ℃离心10 min，收集上清，进行分析。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 色谱分离条件

柱温40 ℃，流速0.2 mL·min-1。正离子模式流动相 A：0.1%甲酸，流动相 B：甲醇；负离子模式流动相 A：5 mmol·L-1醋酸铵(pH 9.0)，流动相 B：甲醇。梯度洗脱程序见表2。

1.4.2 质谱条件

扫描范围选择m/z70～1 050；电喷雾源(ESI)设置如下：喷雾电压(spray voltage)3.2 kV；鞘气流速(sheath gas flow rat)40 arb；辅助气流速(aux gas flow rate)10 arb；毛细管温度(capillary temp)320 ℃。极性(polarity)：正离子(positive)、负离子(negative)；MS/MS 二级扫描为数据依赖扫描(data-dependent scans)。

1.5 数据分析

将数据文件导入 Compound Discoverer 3.1 (CD3.1， Thermo Fisher) 搜库软件中进行预处理，包括峰对齐、峰提取、峰面积定量、标准化、归一化等，最 后得到数据的鉴定和定量结果。预处理后的数据导入SIMCA-P 13.0进行多元化统计分析，包括：主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)；在建立模型的过程中对数据进行置换检验以及变量投影重要度(VIP)的计算。在上述基础上对数据进行单变量统计分析，包括差异倍数(FC)分析以及独立样本t检验。将VIP>1、P<0.05、FC>1.5 或 FC<0.667作为差异代谢物筛选标准。聚类分析采用Origin 2018进行。

表2 色谱梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 主成分分析

PCA得分图(图1)表明，CS组与RSc组在正离子模式下和负离子模式下，组内样本能够聚集到一起，且两组样本之间有明显分离趋势，说明RSc组奶牛与CS组奶牛的血浆代谢物存在差异。

图1 CS组和RSc组PCA得分图Fig.1 PCA scores of CS group and RSc group

2.2 OPLS-DA分析

构建有监督的OPLS-DA模型，进一步判定两组数据之间是否存在差异。OPLS-DA模型得分图(图2)表明，两组样本间有明显的分离趋势。正、负离子模式下，R2Y和Q2均接近于1，说明所建模型具有良好的解释率和预测能力，符合原始样本的真实情况。从OPLS-DA置换检验图(图3)可以看出，正离子模式下数据置换检验截距=-0.88(Q2intercept<0)，负离子模式下数据置换检验截距=-0.76(Q2intercept<0)，说明所建模型的稳定性良好，不存在过度拟合现象。

R2Y代表模型在Y轴方向的解释率，Q2代表模型的预测能力。R2Y represented the interpretation rate of the model in the Y-axis direction， and Q2 represented the prediction ability of the model.图2 CS组和RSc组OPLS-DA得分图Fig.2 OPLS-DA scores of CS group and RSc group

Q2intercept和R2intercept表示Q2和R2回归直线与Y轴的截距。Q2intercept and R2intercept represented the intercept between Q2 and R2 regression lines and the Y-axis.图3 CS组和RSc组置换检验图Fig.3 Replacement test chart of CS group and RSc group

2.3 差异代谢物的筛选

以VIP>1、P<0.05和差异倍数(FC)>1.5 或 FC<0.667为差异代谢物筛选条件，共筛选出41种差异代谢物，其中正离子模式下26种(表3)，负离子模式下15种(表4)。

表3 正离子模式下试验组和对照组鉴定出的差异代谢物

表4 负离子模式下试验组和对照组鉴定出的差异代谢物

2.4 差异代谢物聚类分析

为了更直观地呈现试验组与对照组之间代谢物的差异，对代谢物进行聚类分析，构建热图(图4)。由图可见，两组代谢物之间有明显的区分。

图4 对照组和试验组差异代谢物聚类分析热图Fig.4 Cluster analysis of different metabolites in CS group and RSc group

3 讨论

肾上腺素是肾上腺髓质分泌的主要激素，属于酪氨酸衍生物[13]。当机体的能量状态、营养状态发生改变时，外周感受器便将信号传递给大脑[14]，交感神经作用于肾上腺促使其分泌肾上腺素。肾上腺素有助于调动葡萄糖和游离脂肪酸形式的能量储存，为体力活动或低血糖的恢复做准备[15-16]。本研究试验组奶牛血浆中的肾上腺素水平显著增加(P<0.05)，这一变化可能是由于奶牛从日粮中获得的能量不足，肾上腺素分泌增加，激活激素敏感脂肪酶，促进脂质动员，产生能量以供应机体需求。

β-羟丁酸(BHBA)和非酯化脂肪酸(NEFA)是反映奶牛在组织动员过程中营养状况和对能量负平衡适应的重要代谢参数[17]。研究发现，高能量日粮能够显著提高奶牛产前营养物质消化率和能量摄入量，降低母牛产后血清中的β-羟丁酸和非酯化脂肪酸含量[18]。本研究结果显示，试验组奶牛血浆中的β-羟丁酸的含量较对照组显著增加(P<0.05)，这可能是由于稻草自身能值及动物消化利用率低，供给能量较少，致使奶牛动员自身体脂产生非酯化脂肪酸[19]，通过糖异生增加葡萄糖浓度以维持血糖浓度恒定，而过多的脂肪酸无法全部被氧化分解则缩合形成酮体[20]。肉碱是一种类维生素的水溶性小分子[21]，其主要生理作用是作为载体将胞质中的长链脂肪酸转运进入线粒体基质进行β-氧化，在脂肪分解过程中起重要作用[22-23]。本研究试验组奶牛血浆中的肉碱含量显著增加(P<0.05)，进一步证明奶牛能量不足，脂肪动员分解增强。

脱氧胆酸和胆酸是胆汁酸的重要组成部分，胆汁酸是胆固醇的主要代谢终产物，是肠道营养吸收和胆汁分泌脂类的重要生理介质[24-25]。研究表明，胆汁酸作为信号分子和代谢调节剂，激活核受体和G蛋白偶联受体(GPCR)信号，在调节肝脏脂质、葡萄糖和能量稳态，维持代谢稳态方面具有重要作用[26]。本结果显示，试验组奶牛血浆中的脱氧胆酸和胆汁酸的含量显著增加(P<0.05)，这一变化可能是日粮结构的变化导致奶牛体内的代谢稳态受到影响，肝脏分泌更多的胆汁酸乳化脂肪，促进脂肪的水解代谢及吸收，以此来维持机体能量代谢的稳定。

烟酰胺作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，辅酶Ⅰ)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，辅酶Ⅱ)合成的前体物质，在机体的脂代谢、糖代谢、蛋白质代谢等过程发挥重要作用[27-28]。研究发现，以稻草作为日粮的奶牛丙酸产生量较低，肝脏糖异生作用生成的葡萄糖少。本研究结果显示，试验组奶牛血浆中的烟酰胺含量显著增加(P<0.05)，这可能是由于稻草在奶牛体内的降解率和消化率低，丙酸产量减少，使得机体的糖异生作用增强，需要更多的烟酰胺来合成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ供给糖异生过程。

机体内存在的谷胱甘肽大多为还原型，主要保护红细胞中含硫醇膜蛋白和酶蛋白的完整性及其正常代谢功能，使红细胞免受血液中氧化剂的损伤[29]。本研究显示，试验组奶牛血浆中谷胱甘肽含量明显低于对照组(P<0.05)，可能是由于伴随脂质分解代谢的增强产生大量的脂质过氧化物和活性氧[30]。糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的类固醇激素，用于调节全身代谢稳态，以哺乳动物在应激条件下的生存起到至关重要的作用[31-32]。处于应激状态时，皮质醇能够激活糖皮质激素受体信号通路，增加血浆葡萄糖浓度和肝糖原含量，并且影响细胞应激阈值[33]。本研究表明，试验组奶牛血浆中皮质醇、皮质酮含量显著降低(P<0.05)，因此可推测，稻草替代部分玉米青贮后，机体没有产生应激反应。

4 小结

综上所述，本试验采用LC-MS/MS技术分析稻草替代部分玉米青贮后奶牛的血浆代谢产物变化情况。试验组奶牛血浆中共筛选到41个差异代谢物，其中肾上腺素、β-羟丁酸、肉碱、烟酰胺、脱氧胆酸和胆汁酸等物质的含量升高，谷胱甘肽含量降低，表明稻草替代部分玉米青贮后奶牛脂肪动员增强，机体的糖脂代谢以及抗氧化能力受到了一定程度的影响。