不同移植部位对可注射组织工程化脂肪生存率的影响

吕成鹏，倪 华，李 龙，刘彦普，贺龙龙

（1.西安交通大学口腔医院 陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室 陕西 西安 710004；2.空军军医大学口腔医院组织工程研发中心 陕西 西安 710032；3.广东省深圳市南山区蛇口人民医院口腔科 广东 深圳 518066；4.空军军医大学口腔医院口腔颌面外科 陕西 西安 710032）

颌面部软组织缺损的美学修复是临床工作中经常面临的问题[1-2]。目前，缺损的修复手段主要包括假体的植入、透明质酸充填和自体脂肪移植等，但这些方法都有一定的局限性。假体植入和透明质酸充填由于其可能存在的术后并发症给病人带来风险[3]，而自体脂肪由于其分布广泛、手术操作便捷及无排斥反应和伦理问题越来越广泛地应用于颌面软组织缺损修复，但脂肪移植后不可控的吸收问题为脂肪移植带来困扰[4]。人工诱导脂肪再生（即组织工程化脂肪）技术的出现为软组织缺损的修复提供了新的思路，组织工程化脂肪可通过提供种子细胞、血运条件及再生微环境实现脂肪组织的新生。组织工程脂肪被认为是目前最有前景的治疗软组织缺损的方法[5]。本研究通过将构建的可注射组织工程化脂肪移植于裸鼠皮下不同部位，探讨不同移植部位对可注射组织工程化脂肪生存率的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂：高糖D M E M（G i b c o），胎牛血清（G i b c o），I 型胶原酶（S i g m a），β-甘油磷酸钠（S i g m a），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（I B M X）（Peprotech），吲哚美辛（Peprotech），茜素红（Peprotech）。

1.2 实验动物：6月龄新西兰大白兔3只，体重2.5～3 kg，6周龄雌性裸鼠6只，移植后裸鼠分为两组，裸鼠背部皮下组和裸鼠腹股沟皮下组（同体对照，每组6个位置）。由空军军医大学实验动物中心提供和饲养。

1.3 ADSCs的分离和培养：取新西兰兔双侧腹股沟及颈背部的皮下脂肪，剪碎并清理切取的脂肪组织，用DMEM高糖配制1%I型胶原酶37℃消化1 h；1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入DMEM培养基（含双抗，10%胎牛血清，292 mg/L的谷氨酰胺，50 mg/L的Vita min C）重悬浮；接种于25 cm2培养瓶中，5%CO2，37℃饱和湿度培养，3 d后换液，后隔日换液；5～7 d后按照1∶2比例传代，第二代细胞以1∶3传代。

1.4 ADSCs的成脂、成骨多向分化能力检测

1.4.1 成脂分化能力检测：取第3代的ADSCs细胞，1×105个/cm2接种于1.2 cm×1.2 cm的盖玻片上，细胞密度达80%后加入成脂诱导培养基，3 d换液1次，7 d后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，60%异丙醇淋洗。浸入油红〇染液10 min，60%异丙醇分色至背景无色，双蒸水洗1遍，苏木精复染，晾干，甘油明胶封片，光镜下检查。

1.4.2 成骨分化能力检测：取第3代的ADSCs细胞，1×105个/cm2接种于1.2cm×1.2 cm的盖玻片上，细胞密度达80%以后加入成骨诱导培养基，每3 d换1次液，4周后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，加1%茜素红溶液，37℃染色30 min，双蒸水洗去多余的染料，晾干，甘油明胶封片，光镜下检查。

1.5 富含血小板血浆（PRP）的制备：20 ml无菌注射器抽取抗凝剂枸橼酸钠2 ml，于新西兰大白兔耳中动脉抽取18 ml动脉血，1 500 rpm离心20 min，使PRP/PPP和红细胞分开，超净台内吸取全部上清液、白膜层及以下2 mm的红细胞层，置于抗凝管中，再次以2 000 rpm离心10 min，弃掉部分上清液，剩余液体即为PRP；按照10∶1比例加入激活剂（10%CaCl2+凝血酶），20 s即凝固，将PRP凝胶剪碎平均分成6份，置于4℃冰箱中备用。

1.6 脂肪移植物的制备及移植方法；兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg），取颈背部脂肪清理并修剪，将脂肪组织剪成直径为1 mm的颗粒。每个样本加入1×106个第三代脂肪基质干细胞。1 ml的针管18号白色针头吸取脂肪移植物，在裸鼠背部及裸鼠腹股沟皮下利用针头潜行分离，注射构建的脂肪复合物，背部皮下组及腹股沟皮下组各6个标本，每个点注射0.3 ml脂肪复合体（ADSCs+PRP+脂肪颗粒）。

1.6 B超测量移植物体积方法：测量由2位固定的医生执行以减少系统误差，测量介质为水。测量指标为移植物的长、宽和高，通过计算公式：1/2×a×b×c（a长、b宽、c高）来计算体积[6]，对第1、2、4、6周进行测量。存活率=各时间点测量脂肪体积/0.3×100%。

1.7 统计学分析：统计分析运用SPSS 26.0软件，对不同移植部位的脂肪存活率进行分析。分析方法：运用重复测量的方差分析来评价背部移植组与腹股沟移植组移植物体积随时间变化的差异。

2 结果

2.1 ADSCs的体外培养及多向诱导能力检测：对新西兰兔切去脂肪组织进行原代培养。8 h细胞贴壁，24 h贴壁完成，72 h更换培养液，培养细胞呈多角形、短梭形（图1A），传代后渐渐成为均质的长梭形细胞。取第3代培养细胞进行成脂肪、成骨诱导。加入成脂诱导液后，细胞逐渐变为多角形，3 d后细胞内可见小脂滴形成，4 d后脂滴逐渐变大（图1B）。油红〇染色见红染的脂滴（图1C）。加入成骨诱导液3 d后，细胞变成短梭形，4周后茜素红染色阳性（图1D）。

图1 脂肪基质干细胞（ADSCs）的成脂、成骨诱导

2.2 不同移植部位的可注射组织工程化脂肪存活率：大体肉眼观察，两组移植裸鼠均存活，脂肪移植物健康，无感染及排斥反应发生。随时间变化，裸鼠腹股沟及背部脂肪移植物体积逐渐变小。第6周时，腹股沟移植组脂肪体积明显大于背部移植组（图2）。

图2 两组第1、2、4、6周大体观察

B超对两组移植物不同时间点体积进行测量（图3），并计算存活率。腹股沟组与背部组存活率随时间的推移逐渐降低（表1），第2～4周降幅最大，第6周时腹股沟组的存活率明显高于背部组（P＜0.05），差异有统计学意义。运用重复测量的统计学分析，两组的存活率有显著差异（P=0.033），腹股沟组存活率高于背部组（见表1）。

表1 两组第1、2、4、6周移植脂肪存活率比较 （±s，%）

表1 两组第1、2、4、6周移植脂肪存活率比较 （±s，%）

注：*表示腹股沟组与背部组的重复测量分析有统计学差异（n=6，P＜0.05）,#表示两组第6周比较，P＜0.05。

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图3 两组第1、2、4、6周B超测量脂肪移植物体积变化情况

3 讨论

创伤、感染、肿瘤、先天畸形等各种因素可以导致颌面部软组织大面积缺损，自体组织移植是目前颌面软组织修复重建的主要手段，包括皮瓣移植、皮肤扩张、脂肪移植等技术[7]。其中，脂肪移植因其具有操作简便、取材方便、来源丰富、组织相容性好等特点被广泛运用于临床。随着对脂肪移植研究的不断深入，在移植手术中对于脂肪的获取、处理、移植后处理等环节也得到不断的更新和优化[8]。目前，脂肪移植不仅用于软组织的修复重建，在美容整形领域也有广泛运用[9]。脂肪移植不仅可以单独应用，也可以与皮瓣移植结合使用，术后的效果比传统皮瓣移植更加自然、患者满意度高。而脂肪移植技术在应用过程中也存在移植脂肪吸收率高等难题，其中移植脂肪组织的血供重建是影响治疗效果的关键因素[10]。

脂肪基质干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是组织工程中常用的种子细胞。其具有多项分化作用，在合适的条件下ADSCs能够被诱导成为成脂细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、成骨细胞和内皮细胞；另外，移植的ADSCs能通过旁分泌作用促进组织建立新生血管、调节炎性反应来刺激宿主来源干细胞成脂[11-12]。富含血小板血浆（PRP）能够缓慢释放各种生长因子，可以促进血管内皮细胞再生。PRP与脂肪颗粒联合注射后，可以增大脂肪颗粒周围毛细血管密度，提高脂肪移植的生存率[13]。本课题组[14]通过脂肪基质干细胞复合PRP运用于脂肪移植中，能够显著提高移植脂肪的存活率。

唐军[15]等对Wistar雌性大鼠背部皮下和股二头肌内进行组织工程脂肪移植，发现背部皮下组脂肪存活率优于股二头肌组，认为背部皮下为良好的移植位点。本研究通过将组织工程脂肪复合物移植于裸鼠背部皮下与腹股沟皮下，观察移植物体积变化，从而判断不同部位对于脂肪移植后生存率的影响。通过重复测量的方差分析，腹股沟皮下组移植后体积大于背部皮下组，体积变化差异P=0.033＜0.05，差异有统计学意义；第1、2、4周时，组间对比P＞0.05,组间差异无统计学意义；第6周时，组间对比P＜0.05,腹股沟皮下组体积大于背部皮下组，体积差异有统计学意义。腹股沟皮下脂肪移植能够减少脂肪移植后的吸收。实验结果可能与裸鼠腹股沟皮下血供良好、机械张力小等因素有关，其细胞与分子学机制需要进一步研究。

总之，组织工程化脂肪生存率有耐于良好的成脂微环境，血运供应和机械张力都应该是动物模型建立需要考虑的问题。本研究发现可注射组织工程化脂肪的裸鼠腹股沟皮下移植组存活率大于背部皮下移植，为组织工程脂肪移植受区的选择提供一些参考。