复方祖师麻凝胶贴提取工艺及基质处方优化研究

吕志阳，陈 静，薛 原，张晓蝶，杨佳雯，汤春艳，陈 璟，顾雪梅，杨雨微

（南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300）

祖师麻为瑞香科植物黄瑞香、陕甘瑞香、凹叶瑞香的茎皮和根皮，是西北民间常用药，用于治疗风湿痹痛、活血止痛、四肢麻木、跌打损伤、风湿性关节炎等［1-2］，瑞香素是其发挥镇痛、抗炎功效的主要成分。由于祖师麻有小毒，故大多外用，上市制剂主要为贴剂和软膏，但在应用过程中会有皮肤刺激性，常表现为丘疹等不良反应。有研究采用甘草配伍，可缓解祖师麻毒性和刺激性；课题组前期也发现，甘草配伍祖师麻后，后者抗炎、镇痛效果更好［3］。

复方祖师麻制剂由祖师麻、石菖蒲、栀子、甘草4 味中药组成，其中软膏剂型外用效果较好，但存在剂量不易控制、使用不便等问题。本实验以方中君药祖师麻主要成分瑞香素为评价指标，采用Box-Behnken 响应面法优化提取工艺，并选择高分子材料聚丙烯酸钠NP-700 作为骨架结构，正交试验优化基质处方，再筛选透皮吸收促进剂，最终制得性质优良的复方祖师麻凝胶贴剂，可为后续相关开发利用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号Agilent 1260，美国安捷伦公司）；电子天平（型号Yiii407102，上海菁海仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（型号HHS，金坛市医疗仪器厂）；超声波清洗仪（型号KH-500B，昆山禾创超声仪器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；药物透皮扩散试验仪（型号RYJ-12B，上海黄海药检仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 祖师麻（甘肃泰康制药有限责任公司，批号 110900-201006）；甘草（批号200305）、石菖蒲（批号200915）、栀子（批号200822），均购自南通三越中药饮片有限公司，均经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为正品。瑞香素对照品（成都钠钶锂生物科技有限公司，批号nkl20090207）；瑞香素原料药（上海源叶生物科技有限公司，批号B21084）。

无水乙醇（批号10009218，国药集团化学试剂有限公司）；生理盐水（批号191227-10C，江苏淮安双鹤药业有限责任公司）；氮酮［批号59227-89-3，阿拉丁试剂（上海）有限公司］；聚丙烯酸钠NP-700（批号9Z1470A，广州佳树化工有限公司）；丙三醇（批号20141201，广东光华科技股份有限公司）；甘氨酸铝（批号13682-92-3，上海麦克林生化科技有限公司）；酒石酸（批号526-83-0，上海麦克林生化科技有限公司）。无纺布膏药贴布（批号20210317X，河北省荣轩浩宇有限公司）。

1.3 动物 ICR 小鼠，雄性，体质量（20±2）g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物使用许可证号SYXK（浙）2014-001。

2 方法与结果

2.1 瑞香素含量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.5% 磷酸（48∶52）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。理论塔板数按瑞香素计算，应不低于3 000。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的瑞香素对照品5.14 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 称取祖师麻30 g、甘草20 g，置于圆底烧瓶中，加入8 倍量75%乙醇回流提取2 h，滤过，旋蒸，真空干燥，超声溶解20 min，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2.5 mL，甲醇制成系列质量浓度，分别精密吸取10 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝23.608X－38.554（R2＝0.999 9），在32.18～514 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得瑞香素峰面积RSD 为3.96%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 重复性试验 精密称取祖师麻、甘草各6 份，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得瑞香素峰面积RSD 为4.29%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液适量，于0、1、2、4、8 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得瑞香素峰面积RSD 为0.25%，表明溶液在8 h 内稳定性良好。

2.1.4.5 加样回收率试验 精密称取祖师麻、甘草各6 份，加入约20 mg 瑞香素对照品，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，瑞香素平均加样回收率为98.21%，RSD 为4.66%。

2.2 出膏率测定 取供试品溶液35 mL 至已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，在60 ℃下干燥45 min后置于干燥器中，冷却30 min，精密称定质量，计算出膏率，公式为出膏率＝（干膏质量／药材总质量）×100%。

2.3 提取工艺优化 参考预实验结果，选择乙醇体积分数（A，60%～80%）、乙醇用量（B，6～8倍）、提取时间（C，1～2 h）作为影响因素，瑞香素含量、浸膏得率综合评分Y（Y＝瑞香素含量×0.5＋浸膏得率×0.5）作为评价指标，采用Design-Expert 8.06 软件进行Box-Behnken 响应面设计，优化提取工艺，因素水平见表1，结果见表2。

表1 Box-Behnken 响应面法因素水平Tab.1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表2 Box-Behnken 响应面法设计与结果Tab.2 Design and results of Box-Behnken response surface method

再采用Design-Expert 8.06 软件对表2 数据进行二次多项回归拟合，得方程为Y＝7.04－0.093A＋0.28B＋0.28C－ 0.054AB－ 0.19AC＋0.015BC－0.29A2－0.29B2＋0.12C2，方差分析见表3。由此可知，模型F＝5.18，P＜0.05，表明具有高度显著性；失拟项P＝0.198 6＞0.05，表明未知因素对结果影响较小，拟合度良好；一次项A、B无显著影响（P＞0.05），C有显著影响（P＜0.05），影响程度依次为C＞B＞A；各交互项、二次项均无显著影响（P＞0.05）；模型R2＝0.869 4，表明含量测定值与预测值之间的一致性良好；变异系数（CV）＝3.17%＜5%，校正系数，表明模型可靠，可用于分析预测［4］。

表3 Box-Behnken 响应面法方差分析Tab.3 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

响应面分析见图1。由此可知，固定提取时间不变时，乙醇体积分数曲线变化趋势比乙醇用量更明显，但前者超过70% 后开始下降，可能原因为其过高时会导致部分瑞香素被破坏，使得含量降低，同时溶出其他成分，出膏率随之减少；固定乙醇用量不变时，乙醇体积分数越低，提取时间越长，综合评分越高，并且提取2 h 时最高；各因素影响程度依次为C＞A＞B。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

最终确定，最优提取工艺为乙醇体积分数65%，乙醇用量8 倍，提取时间2 h，综合评分为7.489。按上述优化工艺进行3 批验证试验，测得综合评分为7.851，与预测值7.489 接近（偏差小于5%），表明模型拟合效果良好。

2.4 基质处方优化

2.4.1 凝胶贴制备 取2.5 g 聚丙烯酸钠、17.5 g丙三醇，置于同一烧杯中，室温溶胀2 h，作为A相；取提取物粗粉2 g，加入A 相混匀溶解，作为B 相；取0.1 g 酒石酸加水溶解，再加入0.1 g 甘氨酸铝，混合均匀［5］，作为C 相，将C 相倒入B相中，在磁力搅拌器上300 r／min 搅拌3 min，随后迅速均匀涂在无纺布上，厚度约1.5 mm，室温固化24 h，盖上背衬层，即得［6］。

2.4.2 评价指标测定 以综合感官得分（涂展性、均匀性、皮肤追随性、残留性）及初黏力的总分为评价指标，其中综合感官每项指标最高15分，初黏力40 分，满分100 分，评分标准［7-9］见表4。采用2020 年版《中国药典》 四部通则0952 项黏附力测定法（第一法，即滚球斜坡停止法）测定初黏力，将凝胶贴在温度18～25 ℃、相对湿度40%～70%下静置2 h 后固定于倾斜板上，上端位于倾斜板水平线的下线位置，黏性面向上，沿斜面方向的贴剂长度不超过5 cm，需完整贴合，钢球放在水平线的上线位置，沿斜面自由滚下，重复3次，要求钢球全部粘附，记录可粘住的最大钢球号。

表4 评分标准Tab.4 Scoring standards

2.4.3 正交试验 预实验发现，丙三醇用量在15～20 g 范围内具有较好的保湿性；聚丙烯酸钠NP-700 用量在1.5～3.5 g 范围内较易涂布，而且具有较好的内聚力；甘氨酸铝用量在0.05～0.15 g范围内较易涂布；酒石酸用量在0.05～0.15 g 范围内具有较好的黏性。因此，本实验选择丙三醇用量（A）、聚丙烯酸钠NP-700 用量（B）、甘氨酸铝用量（C）、酒石酸用量（D）作为影响因素，正交试验优化基质处方，因素水平见表5，结果见表6～7。由此可知，各因素均有显著影响。

表5 正交试验因素水平Tab.5 Factors and levels for orthogonal test

表6 正交试验设计与结果Tab.6 Design and results of orthogonal test

最终确定，最优基质处方为A2B1C2D1，即丙三醇用量17.5 g，聚丙烯酸钠NP-700 用量1.5 g，甘氨酸铝用量0.10 g，酒石酸用量0.05 g。

2.4.4 验证试验 按“2.4.3” 项下优化基质处方制备3 批样品，计算总分［10］，结果见表8。由此可知，该工艺稳定可行，并且所得凝胶贴外观光滑平整，无颗粒和气泡，黏性较好。

表8 验证试验结果（n＝3）Tab.8 Results of verification tests（n＝3）

表7 正交试验方差分析Tab.7 Analysis of variance for orthogonal test

2.5 促渗剂筛选 凝胶贴需加入透皮吸收促进剂以提高药物透皮吸收效果，本实验以瑞香素累积渗透量为指标，选择经典辅料氮酮作为促渗剂，考察其用量在5%、3%、1%时的促渗效果［11］。

2.5.1 离体皮肤制备 将小鼠脱颈椎处死，刮净腹部毛发后取下皮肤，去除皮下脂肪和血管，生理盐水清洗干净，置于－20 ℃冰箱中冷藏。透皮实验前取出，放到37 ℃生理盐水中自然解冻，浸泡30 min，再用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干备用［12］。

2.5.2 操作步骤 采用RYJ-12B 型药物透皮扩散试验仪、Franz 扩散池，设置温度为（37±0.2）℃，透皮面积为2.2 cm2，接受池体积为6.5 mL，接受液为生理盐水-无水乙醇（50∶50）。将小鼠离体皮肤固定于接受池上，取凝胶贴1.7 g（有效透皮面积2.2 cm2），平行6 份，在渗透扩散装置的扩散室与接受室之间固定皮肤，外侧朝向扩散室，将凝胶贴固定［13］，接收室中注入接收液，使液面完全与皮肤内层接触，在恒温（37 ℃）、300 r／min 下磁力搅拌，于1、2、4、6、8、12 h 各吸取2 mL透皮接收液，并补加同体积新鲜接收液，滤过，重复6 次，接受液经0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以单位面积累积渗透量为纵坐标，时间为横坐标绘制累积渗透曲线，见图2。

图2 瑞香素累积渗透曲线（n＝6）Fig.2 Accumulative permeability curves for daphnetin（n＝6）

2.5.3 结果分析 由图2 可知，加入氮酮后瑞香素累积渗透量明显升高，不同用量下其促渗效果依次5%＞3%＞1%，即5%氮酮累积渗透量最高，达66.8%，与不加氮酮相比提高近3 倍，故选择其作为透皮吸收促进剂。

3 讨论

复方祖师麻制剂包含祖师麻、石菖蒲、栀子、甘草4 味药材，本实验在优化其提取工艺过程中选择君药祖师麻有效成分瑞香素作为评价指标，主要是因为石菖蒲中细辛醚类成分为挥发油，常需单独提取后采用气相色谱检测；栀子中栀子苷醇得率较高；甘草酸铵在不同提取条件下含量变化不明显。再采用Box-Behnken 法优化提取工艺，可准确预测提取结果，并且浸提效率高，提取完全。

凝胶贴剂因其使用方便、药物吸收良好等优点，已成为经皮给药制剂的研发热点，但在制备过程中常出现黏附力及弹性不够、贴敷易滑落等问题。本实验选择丙三醇、聚丙烯酸钠NP-700、甘氨酸铝、酒石酸等辅料制备复方祖师麻凝胶贴，其配比及加入顺序均会影响制剂成形性，结果发现搅拌时间、速度、温度对其性状影响最大，故把握好搅拌方法是关键所在［14-16］。

复方祖师麻凝胶贴作为经皮给药系统，药物释放、透皮行为是其吸收的前提条件。本实验选择离体动物皮肤作为对象，氮酮作为透皮吸收促进剂，发现其加入量为凝胶贴质量的5%时，12 h 内累积释放率达66.8%。但中药复方中氮酮用量一般不超过5%，故后续考虑采用多元促渗体系，可减少促透剂用量，也能起到更好的透皮吸收效果。同时，也可采用薄荷脑［17］、冰片［18］等中药挥发性成分作为透皮吸收促进剂，既可体现中药制剂“药辅合一” 理念，也可减少辅料用量，提高安全性。