益气调髓方通过骨髓间充质干细胞CD56+来源的外泌体调控软骨细胞活性的机制研究

2023-03-16张扬缪毛毛化昊天成锋童培建

中华骨与关节外科杂志 2023年1期

张扬，缪毛毛，化昊天，成锋，童培建

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）是一类具有多向分化、多因子分泌及免疫调节等特点的多功能干细胞[1-2]。研究发现，BM-MSCs 是一些细胞标志物的异质细胞群，不同的BM-MSCs 亚型细胞异质性程度不同、分化能力也不同[3]。最新研究表明，CD56+BM-MSCs可进行有效软骨细胞分化[4-5]。此外，BM-MSCs 被证实可通过分泌外泌体修复受损软骨组织[6-7]。

益气调髓方（下文简称“YQTS”）由黄芪、杜仲、丹参、当归、菟丝子等药物组成，具有益气活血、补益肝肾、理气止痛的功效[8]，临床应用已有二十余年，疗效确切。临床研究发现，YQTS可治疗膝骨关节炎、骨质疏松等疾病，并有效促进骨髓水肿吸收、修复软骨组织，但其具体机制尚不明确。本研究探究YQTS是否通过CD56+BM-MSCs来源的外泌体调控软骨细胞活性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12只6～8周的雌性健康SD大鼠，体重（200±10）g，SPF级，饲养条件为室温22℃、恒湿、自由饮水。动物使用许可证号为SYXK（浙）20190010，动物实验在浙江省中医药研究院实验动物中心完成。

1.2 材料与试剂

YQTS由黄芪20 g、丹参20 g、杜仲15 g、当归20 g、菟丝子10 g、延胡索10 g组成，方中药材均购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，将上述药材按照1∶10料液比水煎煮提取（煎煮2 次、每次1 h），过滤后合并提取液，浓缩至1 g/ml 备用。DMEM 培养基（ELGBIO，EH80243）、0.25%的胰蛋白酶（ELGBIO，EH80042）、0.2%Ⅱ型胶原酶（Gibco，17101-015）、CD56 小鼠单克隆抗体（Cell Signaling Technology，3576S）、抗CollagenⅡ抗体（Abcam，ab188570）、抗Aggrecan抗体（Abcam，ab3778）、GAPDH单克隆抗体（Cell Signaling Technology，5174S）、抗兔IgG HRP连接抗体（Cell Signaling Technology，7074S）、间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（iCell Bioscience，iCell-MSCYD-003）、CCK-8试剂盒（Solarbio，CA1210）、逆转录试剂盒（Yeasen，11119ES60）、荧光定量PCR试剂盒（Yeasen，10102ES08）、BCA 试剂盒（Thermo Scientific，23227）、PVDF 膜、BSA 试剂、外泌体提取试剂盒（Rengen Biosciences，EXORG10B-1）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药：SD大鼠适应性饲养后，随机分为YQTS 给药组6 只，采用浓缩后的YQTS 药液灌胃1.62 ml/kg，每日3 次；空白给药组6 只，采用与YQTS同等剂量的生理盐水灌胃，每日3 次。两组灌胃2 周后，均给予过量的戊巴比妥钠处死，其中两组各3只用于提取BM-MSCs进行流式细胞检测以及免疫荧光染色实验，两组各3只用于CD56+BM-MSCs外泌体的提取及后续细胞实验。

1.3.2 BM-MSCs提取：两组SD大鼠处死后，分别取胫骨和股骨，剔除表面肌肉和筋膜组织后用PBS 冲洗。将骨头从两端剪断，用注射器吸取适量培养液冲洗骨髓腔，多次冲洗致骨髓腔发白，冲洗液800 rpm/min离心4 min。重悬细胞，将细胞悬液加入预先装有淋巴细胞分离液的离心管中，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层。1600 rpm/min离心15 min，离心后吸取中间白色浑浊的骨髓基质层，800 rpm/min 离心4 min。用含10%FBS的DMEM-F12培养基重悬，接种于细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24～48 h，观察贴壁情况后换液、培养、传代，备用于后续相关实验。

1.3.3 原代软骨细胞培养及软骨细胞特异性染色：SD大鼠处死后，无菌切取关节软骨组织放入培养皿中，PBS 反复漂洗，将软骨剪成大小约1 mm3的小碎块移至离心管中。加入0.02%Ⅱ型胶原酶、DMEM-F12 培养基及双抗，倾斜放置于细胞培养箱过夜；吹打均匀后经150 目筛网过滤收集细胞，1000 rpm/min 离心8 min，吸去上清，加入10%胎牛血清的DMEM-F12培养基，置于细胞培养箱培养。7 d 后开始换液、传代，备用于后续相关实验。

BM-MSCs 加入成软骨诱导分化试剂后，弃去培养基，直接滴加甲苯胺蓝染色3～5 min。弃掉染色液，PBS冲洗2次，显微镜拍照，并统计软骨细胞数量。

1.3.4 流式细胞术检测BM-MSCs 的CD56 表达及细胞分选：BM-MSCs 经胰酶消化离心，重悬后细胞浓度为1×107/ml；两组每管各取100 μl 的细胞，使细胞数达到每管1×106；一抗孵育，空白给药组不加抗体，YQTS给药组加入CD56抗体充分混匀，4℃孵育30 min；用细胞清洗液洗涤2 次，离心弃上清后重悬细胞；二抗孵育，YQTS 给药组加入荧光标记的二抗，4℃避光孵育30 min，清洗细胞；上机检测，分析CD56+/-细胞群占总细胞的比例。

BM-MSCs胰酶消化后细胞悬浮液，1200 rpm/min离心5 min，弃上清。用含4%FBS 的PBS 重悬；加入CD56 单克隆抗体孵育，4℃避光孵育30 min，1200 rpm/min 离心5 min，弃上清，4%FBS 的PBS 重悬。按照流式分选仪的操作步骤收集分选后的CD56+BM-MSCs 细胞，清洗细胞后接种于细胞培养瓶中正常培养。

1.3.5 免疫荧光检测CD56表达：两组细胞分别铺细胞爬片，每个爬片1.5×105个细胞，放入细胞培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，取出爬片，甲醇固定，PBS清洗，用免疫组织化学笔画圈，用羊血清封闭液封闭。一抗加于细胞爬片，4℃避光孵育过夜，PBS清洗。二抗4℃避光孵育过夜，弃去二抗，PBS清洗，DAPI避光孵育，PBS清洗。荧光显微镜下拍照。

1.3.6 外泌体的提取与电镜鉴定：收集CD56+BM-MSCs细胞上清液，4℃，300×g，离心10 min 后小心吸取上清，上清加入超滤管离心管，3500×g 离心30 min，吸取浓缩液，用外泌体提取试剂盒提取后，0.22 μm 过滤器过滤，BCA 试剂盒测外泌体浓度后备用。透射电镜观察并鉴定外泌体。

1.3.7 细胞共培养：分别进行下述三种共培养。

CD56+BM-MSCs 与BM-MSCs 共培养：采用Transwell小室，上室接种空白给药组的CD56+BM-MSCs或YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs，下室接种未经处理的空白组BM-MSCs，置于细胞培养箱中培养。待其贴壁后，将0.4 μm 孔径Transwell 小室加入6 孔板孔中，培养稳定后，在下室中加入软骨细胞诱导分化试剂，分化完成后进行甲苯胺蓝染色及后续实验。

CD56+BM-MSCs 外泌体与软骨细胞共培养：原代软骨细胞稳定培养后，分别加入20 μg 的YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs 外泌体及空白给药组的CD56+BM-MSCs外泌体进行共培养。

CD56+BM-MSCs 外泌体与BM-MSCs 共培养：BM-MSCs 稳定培养后加入软骨细胞诱导分化试剂后，加入YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs 外泌体20 μg（用PBS 混悬），并以等量的PBS 溶液作为PBS对照组，诱导分化10 d 后进行软骨细胞特异性染色及后续实验。

1.3.8 CCK-8 法检测细胞存活率：将细胞悬液均匀接种在6 孔板中，置于培养箱中培养。经过一系列共培养或给药处理后，按照CCK-8试剂盒说明书，避光加入适量CCK-8试剂，于培养箱中培养0.5 h，于450 nm处测定吸光度。细胞存活率%=（YQTS 给药组吸光度/空白给药组吸光度）×100%。

1.3.9 qRT-PCR 检测mRNA 表达：使用Trizol 提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行反转录。荧光定量PCR 反应体系：2x SYBR（由杭州博日科技提供）10 μl，上下引物1 μl，cDNA（由上海生工生物提供）2 μl，ddH2O 6 μl。扩增程序：94℃ 2 min；94℃10 s；60 ℃ 30 s共进行40个循环。TypeⅡCollagen上引物为5'-CAGAGTGGAAGAGCGGAGAC-3'，下引物为5'-GCCGTTCATGGTCTCTCCAA-3'；Aggrecan上引物为5'-AATCCAGAACCTTCGCTCCAA-3'，下引物为5'-GGGCTCGGTCAAAGTCCAGT-3'。

1.3.10 western blot 检测蛋白表达：使用全蛋白提取试剂盒和BCA试剂盒提取并测定细胞蛋白质浓度，100℃变性5 min。使用10%聚丙烯酰胺凝胶，上样20 μg、120 V、2 h。电泳结束后转移至PVDF 膜，5%BSA 室温下封闭1 h。一抗Ⅱ型胶原（1∶1000），Aggrecan（1∶1000），4℃孵育过夜。次日进行PBST/TBST 洗涤，加入二抗（1∶2000），室温孵育1 h。PBST/TBST 洗涤，化学发光底物试剂检测，实验结果导入Image Lab软件，对蛋白灰度值进行分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 YQTS增加CD56+ BM-MSCs数量

两组给药后SD大鼠的BM-MSCs并进行培养、标记及流式检测，结果显示与空白给药组比较，YQTS给药组BM-MSCs的CD56表达明显增加（P=0.001，图1）。免疫荧光结果表明，与空白给药组比较，YQTS给药组BM-MSCs 中CD56 的荧光强度有明显增强。上述结果均表明YQTS 促进CD56+BM-MSCs 的比例增加（图1）。

图1 YQTS对CD56+ BM-MSCs的影响

2.2 YQTS 处理的CD56+ BM-MSCs 对BM-MSCs 软骨分化的影响

Transwell 小室上室接种空白给药组及YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs（接种约4000个细胞），下室接种BM-MSCs（接种约2×105个细胞），并在下室中加入诱导分化试剂，诱导软骨分化（图2A）。分化完成后进行甲苯胺蓝染色，染色结果表明，与诱导剂作用下比较，空白给药组CD56+BM-MSCs 与YQTS 给药组CD56+BM-MSCs 软骨分化效果较好（P=0.002，P＜0.001，图2B、C），且与空白给药组的CD56+BM-MSCs比较，YQTS给药组的CD56+BM-MSCs能有效提高下室BM-MSCs的成软骨分化能力（P=0.009，图2B、C）。qRT-PCR结果表明，与诱导剂作用下比较，空白给药组和YQTS 给药组处理的CD56+BM-MSCsⅡ型胶原的mRNA表达上升（P＜0.001，P＜0.001，图2D）、Aggrecan的mRNA表达上升（P=0.001，P＜0.001，图2D），且YQTS给药组较空白给药组CD56+BM-MSCs，Ⅱ型胶原的mRNA 表达上升（P=0.002，图2D）、Aggrecan的mRNA表达上升（P=0.001，图2D）。Western blot结果表明，与诱导剂作用下比较，空白给药组和YQTS 给药组CD56+BM-MSCs能促进软骨细胞分化过程中的Ⅱ型胶原蛋白表达（P=0.030，P＜0.001，图2E、F）、Aggrecan 蛋白表达（P=0.001，P＜0.001，图2E、F），且YQTS给药组较空白给药组能进一步提高Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan蛋白表达（P=0.002，P=0.009，图2E、F）。

图2 YQTS处理的CD56+ BM-MSCs对BM-MSCs软骨分化的影响

2.3 YQTS 处理的CD56+ BM-MSCs 的外泌体对BM-MSCs软骨分化影响

2.3.1 YQTS 处理的CD56+BM-MSCs 外泌体促进软骨细胞增殖：提取CD56+BM-MSCs 的外泌体进行鉴定。根据电镜及纳米颗粒跟踪分析仪结果显示，外泌体呈现典型的脂质双分子层结构，且颗粒大小在30～150 nm（图3B）。

96 孔板中每孔接种2000 个软骨细胞，贴壁24 h，各加入20 μg 的YQTS 给药组和空白给药组的CD56+BM-MSCs外泌体培养48 h，CCK-8检测结果示YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs 外泌体与软骨细胞共培养后，软骨细胞增殖率高于空白给药组的CD56+BM-MSCs外泌体（P=0.012，图3C），表明YQTS处理的CD56+BM-MSCs外泌体促进软骨细胞增殖。

2.3.2 YQTS 处理的CD56+BM-MSCs 的外泌体促进BM-MSCs软骨分化：接种BM-MSCs（约2 万个细胞）于35 mm 皿，各给药组均加入诱导分化试剂，分别加入PBS 对照组及YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs外泌体20 μg（PBS混悬），诱导分化约10 d，用软骨染色试剂盒检测下室软骨分化程度，结果显示与不加外泌体的PBS 对照组相比，加入YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs外泌体处理的BM-MSC软骨分化程度更高，分化效果更为明显（P＜0.001，图3E、F）。

qRT-PCR 结果表明，与不加外泌体的PBS 对照组比较，加入YQTS 给药组的CD56+BM-MSCs 外泌体后，Aggrecan 和Ⅱ型胶原的mRNA 表达均显著上升（P=0.002，P=0.002，图3G），说明YQTS 处理的CD56+BM-MSCs 外泌体对BM-MSC 的Ⅱ型胶原、Aggrecan的mRNA表达有促进作用。

Western blot 结果显示，与不加外泌体的PBS 对照组比较，加入YQTS给药组的CD56+BM-MSCs外泌体后，Aggrecan蛋白水平有所提升（P=0.005，图3H、I），Ⅱ型胶原蛋白水平显著升高（P＜0.001，图3H、I），说明YQTS处理的CD56+BM-MSCs外泌体对BM-MSCs的Ⅱ型胶原和Aggrecan的蛋白表达有促进作用。

图3 YQTS处理的CD56+BM-MSCs外泌体对BM-MSCs软骨分化的影响

3 讨论

软骨是一种由致密细胞外基质组成的高度结缔组织，软骨细胞是软骨组织中的功能细胞，也是分泌细胞外基质的唯一效应细胞[9-10]。因软骨及软骨细胞的再生能力及自我修复能力有限，常导致骨关节炎等各类骨科疾病的发生[11-12]。近年来，BM-MSCs 在关节软骨上的作用受到广泛而持续地关注，但由于BM-MSCs种类的复杂性、多样性，使得其维持分化成软骨表型仍是一项重大挑战[13]。研究表明，BM-MSCs是一些细胞标志物的异质细胞群，不同的细胞亚群具有不同的标志物，且分布、分化过程均不同。近年来，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）技术为探究BM-MSCs的异质细胞亚群提供了新的方法[14-15]。运用单细胞RNA测序技术在LEPR+/CD45-BM-MSCs中鉴定出不同的细胞亚型，其中表达CD56亚型具有软骨分化潜能，被视为软骨细胞前体，且该细胞亚群主要位于生长板。另有研究表明，CD56+BM-MSCs 在不同异质性骨髓间充质干细胞中表达有差异，且CD56 介导软骨前体细胞与软骨细胞的细胞间通讯[16]。因此，推测CD56+BM-MSCs可能是BM-MSCs修复软骨损伤过程中主导细胞迁移和分化的重要细胞类型。外泌体是目前发现的介导细胞间通讯的新机制，研究表明BM-MSCs 来源的外泌体具有促进软骨细胞增殖的作用，通过介导BM-MSCs和软骨细胞之间的细胞间通讯，修复软骨损伤，减轻膝骨关节炎的疼痛[17]。BM-MSCs可通过外泌体中的miR-127-3p抑制软骨细胞中的钙黏附蛋白11，从而阻断Wnt/β-catenin通路的激活，减轻骨关节炎中软骨细胞的损伤；BM-MSCs 来源的外泌体miR-136-5p 可以促进软骨细胞迁移，抑制体内软骨变性[18-19]。

本研究团队一直致力于“髓系骨病”的研究，将骨关节炎、股骨头坏死等骨病概括为“髓系骨病”，认为其发病机制是由于患者骨枯髓减，肾虚则骨弱髓空，不能束骨而利关节也。“髓系骨病”的治法根本在于调髓，调髓治法在细胞层面的解释即指调动BM-MSCs的迁移、分化与归巢，调节成骨细胞-破骨细胞的偶联平衡及修复软骨组织等，进而恢复并维持骨稳态，达到“髓足骨健”的效果[20]。已有文献报道指出，黄芪、杜仲、菟丝子等均具有促进BM-MSCs 成软骨分化的作用[21]。基于“髓系骨病”的理论，临床上采用YQTS 治疗股骨头坏死、膝骨关节炎等骨病的疗效显著。

本研究采用YQTS 进行大鼠灌胃给药，给药后提取大鼠BM-MSCs，通过流式细胞术鉴定CD56 标记细胞亚型在BM-MSCs 中的比例显著增加，且与免疫荧光结果相同，提示YQTS 给药后增加CD56+BM-MSCs 的数量。采用CD56+BM-MSCs 与BM-MSCs 共培养的细胞模型，结果发现YQTS 给药后提取的CD56+BM-MSCs 能促进BM-MSCs 的软骨分化，并增加软骨分化标志物Ⅱ型胶原、Aggrecan的表达。在上述实验结果的基础上，进一步对CD56+BM-MSCs 来源的外泌体进行提取，并将其与BM-MSCs共培养，发现CD56+BM-MSCs来源的外泌体能显著提高BM-MSCs 的软骨分化效能。上述结果证实，YQTS 的调髓机制可能是通过促进CD56+BM-MSCs 亚型的增殖及CD56+BM-MSCs 来源的外泌体的分泌，进而促进软骨分化（图4）。