生物医学工程技术在螺旋神经节神经元再生中的应用研究进展

郑莎莎,崔庆悦,齐艳茹,程 红,魏 浩,胡扬楠,柴人杰,,4,5,6

(1.东南大学数字医学工程全国重点实验室,附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科,生命科学与技术学院,生命健康高等研究院,江苏省生物医药高新技术研究重点实验室,江苏 南京 210096;2.南通大学神经再生协同创新中心,江苏 南通 226001; 3.南京大学医学院附属鼓楼医院耳鼻咽喉头颈外科,江苏 南京 210008;4.四川省医学科学院·四川省人民医院耳鼻咽喉头颈外科,四川 成都 610072;5.中国科学院干细胞与再生医学研究中心,北京 100101;6.首都医科大学北京市神经再生修复研究重点实验室,北京 100069)

听力损失影响患者的沟通、认知、教育甚至心理健康,对患者的生活质量有着重大影响,给社会带来经济负担。在所有听力损失中,感音神经性耳聋( sensorineural hearing loss, SNHL )是最常见的类型,占绝大多数[1]。SNHL是很常见的耳疾,全世界约有3.6亿人口患有此病[2],其核心原因是耳蜗毛细胞的损伤和毛细胞损伤之后的螺旋神经元(spiral ganglion neurons, SGNs)的神经突退化和细胞死亡。人工耳蜗(Cochlear implant, CI)是目前治疗重度、极重度感音神经性耳聋最有效的方法[3],但功能性螺旋神经元数量不足是影响CI植入效果的重大医学难题[3]。因此,保护或修复受损的螺旋神经元是治疗感音神经性听力损失的有效途径,也是听觉再生领域的重要研究方向。生物医学工程是近年来逐渐兴起的一门交叉学科,其将工程学的技术、原理和设计概念应用于生物学和医学,其研究目的是提高生活质量,减少疾病对个人生活的影响。生物医学工程研究领域广阔,包括生物材料、组织工程、生物仪器、生物信号等学科[4]。近年来,生物医学工程技术在基础研究方面取得了很大的成绩,主要应用于骨软骨[5]、肌肉[6]、皮肤[7]、肝脏[8]等组织的再生中,本文将介绍其在SGNs再生中的应用。

1 SGNs

耳蜗中的SGNs可分为I型SGNs和II型SGNs两个亚组。I 型 SGNs占内耳听觉神经元的大多数,是有髓鞘的、大的双极细胞,它们将复杂的声学信息通过周围树突从内毛细胞传递到中枢神经系统[9],而II 型SGNs是无髓鞘的、小的单极细胞,支配外毛细胞和为部分支持细胞提供感觉反馈,控制听觉上皮层对声音信号的敏感性[10]。发育水平上,SGNs属于终末分化细胞,不能自发增殖再生,因此SGNs的变性或者损失对听力具有严重的破坏性[4],进一步导致永久性SNHL[12]。所以SGNs的修复在治疗听力障碍相关的生物医学领域至关重要。CI是一种有效的治疗手段,但限制CI有效性的因素是电极阵列和SGNs之间存在的解剖间隙,导致电流在非特异性刺激下扩散[13]。其中一个解决方法是引导SGNs的神经突向刺激电极方向生长[14]。因此,维持和促进SGNs的存活和神经突生长,并引导其向靶点方向发展,对于提高的CI表现至关重要。

2 生物医学工程在SGNs再生中的应用

再生损伤的听觉神经的传统的方法包括:局部提供神经营养因子[15]、干细胞治疗[16]、基因治疗[17]等,在这些治疗方法中,一种前景广阔的听觉神经修复方法是运用生物医学工程中的组织工程技术。研究表明,组织工程技术可以体外模拟复杂的组织微环境,为修复损伤的组织和器官提供了一种新兴方法[18]。其中,使用具有可调性和独特性能的仿生支架进行引导神经突的生长是其方法之一[19]。

2.1 仿生支架调控仿生支架有着与天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相似的特性,通过其结构和功能来指导新组织的形成[20]。理想的仿生支架应当具备生物相容性和可降解性,不会引起周围组织的炎症反应或者毒性反应[21],还应当为细胞提供机械和结构支持,减少神经轴突分散,以促进细胞附着、生长和增殖[2]。此外,还应该具备独特的性质,例如能够引导神经突生长排列,适当的电连接等[19]。

2.1.1导电生物材料 支架电信号是神经元与其他细胞交流的方式,这在神经发育和成熟过程中具有重要意义。基质的导电性有利于细胞间电信号的传递,或有效地向细胞传递外部电信号[22]。因此,导电生物材料在神经组织工程中得到了广泛的应用。Hu等通过将超顺排碳纳米管(super-aligned carbon-nanotube sheets, SACNTs)组装到的甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin, GelMA )水凝胶上来构建支架,他们制备的复合材料继承了GelMA水凝胶的良好生物相容性和碳纳米管的高导电性。研究结果表明,GelMA - SACNT促进了SGNs的定向排列和神经突的生长,同时促进了依赖钙离子的神经元信号的传递[23]。在另一项研究中,他们将SACNTs集成到大蓝闪蝶鳞翅上,并通过GelMA水凝胶促进SACNTs与鳞翅的结合,提高支架的生物相容性。其三维的有序拓扑结构能够诱导SGNs的取向排列,并促进SGNs神经突的定向生长[24]。

2.1.2磁性诱导 此外,神经再生除了需要新生神经元的功能成熟外,还需要新生神经元突起的定向生长。磁性纳米颗粒在外部如热、光和磁场等刺激下,可以产生物理化学变化,已广泛应用于生物医学领域[25]。它们具有高稳定性、无细胞毒性和生物相容性的优点,在磁场下具有高磁化强度[26]。基于此,Xia等通过磁性胶体纳米颗粒(Fe3O4内核和SiO2外壳)在磁场作用下的自组装,制备了具有各向异性的磁性胶体纳米链,并从接种的SGNs 中发现新生神经突起沿着纳米链的良好取向,诱导了种子SGNs的排列,种子SGNs的生长锥发育和突触形成得到了促进,这对再生过程中神经网络的重排和神经信号通讯的恢复具有重要意义。值得一提的是,通过调节磁场,可以构建多向可逆的纳米链,从而实现SGNs向多个方向定向排列[27]。最近的研究已经证明了另外一种磁性纳米颗粒:超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)纳米颗粒指导轴突取向的能力[28],Hu等的工作进一步证明了SPIO纳米颗粒对SGNs具有良好的生物相容性,并且由SPIO纳米颗粒在磁场内产生的机械张力可以促进神经元生长并引导SGNs神经突的方向,这使得操纵和定向轴突以实现所需的方向生长成为可能[29]。

2.1.3水凝胶支架 在生物材料中,水凝胶具有优异的物理和化学性质,例如高度吸湿性、可调节的机械性能、以及易修饰的三维交联网状结构[30]。在之前的研究中,原代SGNs的细胞培养方案一般为二维培养,但Yan等的研究证明三维培养系统相比较二维更有利于保存SGNs的精致结构和功能。他们利用转基因小鼠纯化SGNs群体,建立了3D基质培养系统,并证明3D基质培养环境显著提高SGN体外存活率,并且克服了2D系统的培养时长上限,促进了整个培养期间SGNs的存活,并维持了其形态结构和功能。因此三维基质培养环境可以作为长期培养纯化的SGNs生理和病理研究的有用工具[12]。这些性质对于细胞的生长和成熟非常有益,也使水凝胶成为最有潜力的支架材料之一。自组装多肽基水凝胶由于其形成的三维纳米结构模仿ECM环境,并且生物活性可以被特异性地控制而受到特别关注[31]。肽基水凝胶的主要优点包括其生物相容性、作为溶液的可注射性以及易于分子修饰。为了模拟自然的细胞环境,ECM衍生物——层粘蛋白中的生物活性表位IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val)可以共价偶联到水凝胶形成肽上,在IKVAV -肽基水凝胶中观察到它促进了培养的神经元的神经突生长[32]。这个结果强调了生物功能化多肽水凝胶在神经再生中的潜力。

2.2 电刺激调控由于CI的整体效果较好,越来越多的残听患者接受了CI植入,术后患者通常会保留低频的残余听力。CI是电刺激的产生者,然而,关于电刺激对神经行为的影响仍存在争议。Shen等结果表明,当电刺激强度大于50 μA或者刺激时间超过8小时后,电荷平衡双向电刺激可显著降低SGNs神经突的长度[33]。然而,有研究表明电刺激可以直接激活SGNs及其周围突起[34];此外,还有动物研究表明,与未治疗的对照组相比,经电刺激治疗的动物的螺旋神经节神经突明显更长[35];Scheper等的研究结果则发现电刺激可以提高SGNs的存活率[36]。研究结果的差异可能是由于电刺激对各种细胞行为的调节取决于细胞类型、状态和电刺激的参数[37]。

为了深入研究电刺激对SGNs生长的调控模式,多位研究者开发了体外电刺激研究体系。Peter等所开发的刺激室和装置用于体外电刺激参数筛选,该装置具有一个可以改变电流幅度和脉冲宽度等参数的径向电场的刺激室,以实现对SGNs的体外电刺激。研究结果提供了参数集/电荷密度,可用于体外研究电刺激对SGNs损伤的影响,并筛选保护策略,以维持和保护植入物患者的残余听力[38]。我们团队开发了一种高效的CI电声刺激(electroacoustic stimulation, EAS)系统,并将不同的导电材料引入到该电刺激培养体系中,探究了该系统对SGNs生长发育的调控作用。我们发现CI/石墨烯EAS系统的长期刺激可促进SGNs生长锥的发育,从而促进其神经突的生长[39]。同时还发现该体系能够促进神经干细胞向神经元的分化,并促进新生神经元的生长,为人工耳蜗植入与干细胞移植相结合的治疗体系提供了理论基础[40]。为了更好地模拟体内微环境,我们将导电材料MXene引入三维Matrigel基质胶中,进一步与系统整合构建了三维的基于人工耳蜗的电刺激系统,并发现在该系统中低频电刺激能够促进SGNs神经突的生长及突触发育,并且能够促进由Ca2+介导的细胞间的信号传递[41]。相关的研究结果可能为临床上人工耳蜗的使用提供深刻的见解,从而对SNHL患者有所帮助。此外还有诸多在动物模型上的研究表明耳蜗内慢性电刺激可减少SGNs变性[36,42,43],然而这些研究主要集中在豚鼠、大鼠和猫等小动物上,在今后的研究中,还需进一步在猴、猪等大动物模型中验证这些电刺激模式对内耳SGNs的影响。

2.3 联合调控策略SGNs的发育和维持结合多种治疗策略,可能会取得更好的效果[44]。耳聋动物耳内外源性或转基因神经营养因子如神经营养因子-3和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)可促进SGNs神经突的再生,这些新生的神经突可能会减少CI植入电极与其靶向SGNs之间的间隙,从而提高电刺激的空间分辨率[33]。有很多研究者探究了营养因子和电刺激联合调控对SGNs的影响。Shepherd等发现当BDNF和电刺激的联合给药时,对SGNs的保护效果更好[45]。CI植入是电刺激的产生者,Wey等也证明了SGNs在CI植入物上的生长将通过BDNF等刺激蛋白的分泌而增强[46]。此外,神经营养因子和支架的联合作用也被讨论。研究表明,用硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)和BDNF同时治疗SGN外植体可促进神经突生长增强[47]。Wille等在携带HS涂层的可生物降解聚合物纤维中加载了BDNF,结果发现从纤维中递送的BDNF大大提高了SGNs在体外的存活率,它们为进一步发展未来的神经元引导支架提供了有前途的基础材料[14]。

根据近年来SGNs再生的基础研究,可以通过干细胞的自我更新、低免疫原性、迁移能力和分化成不同类型细胞的潜力来替代SGNs不可再生的损失[40]。因此,将各种调控因素与干细胞移植有机结合可能对SGNs的再生有重大意义。Zhang等提出干细胞疗法与人工耳蜗相结合可以提高人工耳蜗的性能[44]。Guo等研究表明,基于CI的EAS系统能够显著促进NSCs的向神经元的分化并促进新生神经元的成熟,暗示将人工耳蜗植入与神经干细胞转移植相结合可能是进一步提高人工耳蜗植入效果的有效治疗策略[40]。另外,将神经营养因子与干细胞联合使用,能够成功再生啮齿动物的SGNs,这推进了CI植入技术的巨大发展[48]。综上所述,整合多种策略的联合调控方案可能是再生SGNs的有效手段。

3 展望

CI的出现已经改变了成千上万的听力损失患者的生活,但要想让那些接近自然听力的人获得更好的结果,还需要对治疗方法进行改善。利用生物医学工程技术制备出更适合SGNs的仿生支架是一种有前景的方法,例如活体电极等;此外使用有利于SGNs生长的材料也是未来的研究方向之一,例如导电水凝胶,还可以开发新的基于肽的水凝胶,使其在生理条件下自组装,这些水凝胶有望在SGNs和CI之间创建无间隙界面。此外,光学刺激被认为是传统电刺激的替代方案,因为它可以克服CI电流传播的固有限制——电流扩散引起的分辨率问题,并且可以精确地调整到模拟复杂声音所需的频率和强度分辨率[49]。理想情况下,这种方法将在生物医学设计中创造巨大的应用价值。