原生质体融合技术在食用菌遗传育种中的应用概述

夏会楠 李东晓 赵玉阳 王春霞 郑素月 郭金英

（河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056038）

食用菌俗称蘑菇又名蕈菌，是一种可食用的大型真菌，不仅味道鲜美、营养丰富，还含有药食同源的生理活性成分，可用于食品加工、保健品开发以及医药产业等领域[1]。目前，我国食用菌栽培技术已十分成熟，但品种较少。食用菌品种选育的主要手段有原生质体融合、杂交、野生菌驯化等[2-3]。原生质体融合又被称为体细胞杂交技术[4-5]，20世纪70年代开始应用于食用菌领域。随着食用菌产业的发展，为培育出高产、抗逆性强、适应性强的优良新品种，学者将原生质体融合技术逐渐应用到食用菌菌株（品种）改良以及选育中。武秋颖等[6]以高产、抗逆性强的平菇Pleurotus ostreatus菌株CCEF89 和适应性强的杏鲍菇Leurotus eryngii菌株PL7 为试验材料，建立原生质体PEG 融合体系，通过拮抗反应试验及Rep-PCR 分子鉴定方法鉴定融合子，然后选择菌丝长势强的融合子进行出菇试验，以此选育平菇新菌株，同时为食用菌育种提供新的种质资源。原生质体融合技术也是改进真菌菌株代谢物谱和生物量产量的有效手段[7]。骈永茹等[8]采用单因素及正交试验方法，优化巨大侧耳Pleurotus giganteus原生质体制备条件，为巨大侧耳杂交育种，全基因测序以及遗传转化提供优良菌株。REN 等[9]采用原生质体制备结合化学诱变法改良灵芝菌株，改良后灵芝菌株的多糖及三萜类化合物合成能力强，且具有稳定遗传性。随着生物技术的发展，原生质体融合技术将会为食用菌育种提供一个广阔的平台[10]。

笔者概述原生质体制备、融合方法及原生质体融合技术在新品种选育上的应用，展望未来应用前景，为食用菌遗传育种提供参考。

1 原生质体制备及再生

1981年食用菌溶壁酶的出现，使原生质体融合育种技术取得突破性进展[7]。食用菌在进行原生质体制备时，原生质体再生率易受外界条件影响，如菌龄、酶含量、酶解时间以及酶解温度。RAMAN 等[4]通过GPE（聚乙二醇）诱导融合技术进行灵芝Ganoderma lucidum种间杂交，当酶解时间为2.5 h 时原生质体再生率最高，原生质体产量为6.40×105个/mL。许琳等[10]以灵芝Ganoderma lucidum（赤芝及无柄灵芝）为试验材料，采用单因素及正交试验，优化原生质体制备条件，结果表明，赤芝菌丝菌龄为10 d，酶解温度为35 ℃，酶解时间为3 h时，原生质体产量最高，为9.75×107个/mL。李良敏等[7]优化糙皮侧耳Pleurotus ostreatus、双孢蘑菇Agaricus bisporus、中国美味蘑菇A.sinodeliciosus的原生质体制备方法，将铺有玻璃纸的培养基中培养3 d 的菌丝转至培养皿后，直接加入溶壁酶，酶解60 min，获得原生质体106～107个/mL。此方法节省时间，操作简便，不易污染。

2 原生质体融合方法

2.1 原生质体自发融合

原生质体可以自发性融合，人为去除细胞壁后的原生质体之间具有胞间连丝，由于胞间连丝黏连或者伸缩使得同类的两个细胞发生融合，进而产生融合体。研究表明，适度的干旱条件有利于原生质体的融合[8]，但原生质体自发融合仍比较困难。

2.2 人工诱导原生质体融合

人为干预亲缘关系较远的原生质体，不仅能促进其融合，还提高融合效率[8-9，11]。研究者常采用物理及化学方法来促进原生质体融合。聚乙二醇常被用作促进原生质体融合的化学诱导剂[12-13]；物理方法有离心、振动、电刺激[14-18]。

3 原生质体融合技术在食用菌遗传育种中的应用

3.1 食用菌颜色遗传规律研究应用

食用菌品种繁多，色泽多样，如金针菇有白色、黄色，真姬菇有白色、灰色。为满足人们对食用菌颜色喜好，菇体颜色也成为食用菌育种的重要目标性状[5]。武秋颖等[6]进行交配型的原生质体单核菌株配对杂交获得F1 代，将F1 代子实体的孢子单核菌株与亲本进行回交配对，观察菇体颜色，分析子实体颜色遗传规律。谢宝贵等[14]分析白色、黄色金针菇Flammulina velutipes杂交品种菇体颜色遗传规律，发现黄色、白色是一对相对性状，受一对等位基因控制。刘新锐等[15]以柱状田头菇Agrocybe cylindracea白色变种Ag.c0002、野生型Ag.c0067 为亲本，进行两者原生质体单核菌株杂交，结果表明，柱状田头菇菇体颜色是受一对等位基因控制。盛春鸽等[16]以白黄侧耳Pleurotus cornucopiae的白色菌株CCMSSC00358 及深灰色菌株CCMSSC00406 为试验材料，采用自交、回交的方式研究子实体颜色遗传规律，结果表明，白黄侧耳的颜色性状为数量性状，灰色对白色为不完全显性，由不同位点上的两对基因控制。张泽华[17]以桃红侧耳Pleurotus djamor的粉红色菌株CCMSSC00450、灰褐色菌株CCMSSC04445 为试验材料，研究其颜色遗传规律，将通过原生质体融合技术获得的不同交配型的单核菌株配对杂交得F1 代，根据F1 子实体颜色，推断相对性状的显隐性，再通过单孢回交的方法构建测交群体进行数据分析，结果表明桃红侧耳子实体颜色是由多基因控制。原生质体单核化杂交为子实体颜色遗传规律研究以及后续食用菌育种提供基础，将不同优良性状组合到杂交子中，根据市场需求制定育种目标，将其应用到生产实际中，为食用菌颜色定向育种提供理论依据[14-15]。

3.2 选育食用菌优良菌株应用

随着食用菌产业化的不断发展，丰富食用菌种质资源，培育高产、稳产、优质、稳定遗传的菌株是食用菌育种的重要目标之一。王波[3]采用原生质体制备技术获得高产优质的黄色金针菇Flammulina velutipes，已大面积用于生产。刑振楠等[12]利用原生质体融合技术选育抗逆性强、产量高的香菇Lentinus subnudus菌株，经过DUS测试可以进行推广。

3.3 食用菌杂交育种应用

根据不同的育种目标，通过灭活处理原生质体进行不同属之间的原生质体融合获得新的重组子，选育出高产、稳产、优质、抗病性强的优质杂交新菌株[13]。钱可晴[18]采用原生质体融合技术进行玉木耳Auricularia cornea与冰糯耳Auricularia heimuer杂交，获得稳定遗传的纯白色黑木耳优良菌株，不仅为生产提供优良菌株，也为后续杂交育种提供优良的种质资源。SINGH等[2]进行双孢蘑菇Agaricus bisporus、姬松茸Agaricus blazei原生质体融合子筛选，并研究优质融合子的菌丝形态、生长速度。陈小红等[19]为获得茯苓育种的漆酶转化体系，以灵芝Ganoderma lucidum与茯苓Wolfiporia cocos为试验材料，通过原生质体亲本灭活处理将灵芝的漆酶基因转入茯苓中获得优良茯苓新菌株。肖在勤等[20]进行金针菇Flammulina velutipes与凤尾菇Pleurotus pulmonarius原生质体融合育种，选育出远缘原生质体融合菌株金凤221，该结果引起食用菌界广泛关注。蔡佺佑[21]为获得兼具秀珍菇与巨大口蘑共同优良特性的新菌株，进行秀珍菇Pleurotus geesteranus与巨大口蘑Tricholoma giganteum的原生质体融合育种。郑锦荣[22]、吴晓华[23]进行金针菇Flammulina velutipes、巨大口蘑Tricholoma giganteum原生质体融合育种，获得生长周期短的巨大口蘑新菌株以及高温下可以生长的金针菇新菌株。

4 展 望

原生质体融合技术自应用以来备受科研工作者的重视与关注，科研工作者经过不计其数的试验获得许多新品种。通过原生质体融合育种杂交获得稳产、优质、抗病、抗虫的优良菌株，能稳定遗传的少之又少[24-25]。并且，仍有很多食用菌品种尚未建立相应的杂交体系，不利于原生质体融合育种技术的发展[26-27]。但随着分子生物技术（酯酶同工酶、RAPD、分子标记、原生质体灭活）在原生质体融合领域的发展，家族间远缘杂交将取得重大进展，原生质体融合技术也将在食用菌领域迅速发展[28-29]。