羊肚菌连续继代培养对菌丝老化的影响

●田 芳 金 丽 李 宾（郑州市农林科学研究所 河南 郑州 450007）

羊肚菌是一种珍稀的食用菌，隶属于子囊菌亚门，因形似羊肚而得名。羊肚菌具有高蛋白、低热量的特征，兼具保健功能，深受大众的喜爱。自从2012年羊肚菌在我国开始规模化的人工栽培，种植面积和规模逐年增加。菌种质量的好坏直接决定着羊肚菌最终的产量和品质，菌种的退化会直接造成羊肚菌的减产甚至绝收，因此研究菌丝老化现象对羊肚菌产业发展至关重要。目前，关于羊肚菌继代培养与菌丝老化关系的研究较少，结果也不相同。刘伟等[1]研究表明，10个高羊肚菌菌株在继代培养中，菌丝老化启动阶段，生长速度无明显变化，只是形态上主菌丝会变的稀疏；老化死亡阶段，生长速度急剧下降，菌丝边缘变的不整齐。钱可晴等[2]研究发现，梯棱羊肚菌在继代培养中生长速度呈逐渐下降趋势，第15代菌丝停止发育。刘璐[3]发现“六妹”羊肚菌的生长速度呈现先上升后下降的趋势，在第8代时达到峰值。由此推测，不同品种、同一品种不同菌株的羊肚菌，其衰老特性不同，因此进一步研究不同菌株的衰老特性很有必要。

老化是一种自然现象，在生物界普遍存在，目前对真菌的老化，并没有统一明确的理论解释，支持较多的是与自由基的积累、线粒体DNA受损相关，其过程受到细胞质遗传因子的调控[3-4]。但羊肚菌作为微生物界更为低等的子囊菌，菌丝更容易老化，其老化现象也更为普遍，老化会造成菌丝活力下降甚至停止发育。然而，在生产中，通过继代培养扩繁菌种的现象较为普遍。另外，在菌种的低温保藏过程中，试管也需要定期进行一次继代，以保持菌种的活力。何培新[4]认为，连续继代培养20代以上仍未出现明显老化的菌株，才能作为潜在的优良菌种，菌种老化程度与羊肚菌的最终产量呈负相关，“六妹”羊肚菌在继代培养的第2代，梯棱羊肚在第6代，栽培产量下降50%[3，5-6]。因此，播种前最好对菌种的活力进行测定，确保菌种质量较佳。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株所有菌株均为郑州市农林科学研究所在河南和新疆试验基地经过3～5年驯化后筛选所得的优良菌株。代号中的“7”代表“七妹”羊肚菌，“6”代表“六妹”羊肚菌，2018LM代表2018年四川引种后连续种植4年后筛选的优良菌株。融合种是由引自榆林的“七妹”和引自四川的“六妹”通过原生质体制备、再生后筛选得到的改良菌株。701M1和701M4为分离同一菌株子实体得到的不同组织块，其他均来自不同羊肚菌菌株的子实体（表1）。

表1 供试菌株的代号及引种地统计

1.1.2 供试培养基PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂22 g，葡萄糖20 g，加水至1000 mL，pH自然。121℃高压灭菌20 min，冷却至50℃下，在超净台中倒入9 cm平板即可。

1.2 方法

1.2.1 母种的获得采用干菇组织分离的方法获得。待子实体生长至七八成熟，菌盖上的褶还未完全展开即可采集所需菌株，选取形态好、肉厚、菌柄白、无病害的羊肚菌子实体带回实验室阴干，做好菌株标记。在紫外消杀后的超净工作台中，先用手术刀从子实体的菌盖和菌柄交接处切下1 cm×1 cm大小的组织块，放置于10 mL无菌离心管中，加入无菌水浸泡5 min左右，组织块膨大变软即可，倒掉废液，无菌水冲洗一次，将组织块取出置于装有75%乙醇的10 mL无菌离心管中，准确计时消毒15 s，迅速用镊子将组织块取出置于新的无菌水中浸泡，反复冲洗3次，随后取出组织块置于无菌滤纸上，吸干水分。最后在无菌滤纸上用无菌解剖刀切掉组织块边缘，分成0.5 cm×0.5 cm大小的块，放置在PDA平板上22℃黑暗培养2～3 d，至菌丝萌发至直径3～5 cm即可进行纯化获得母种。

1.2.2 继代培养用直径5 mm的打孔器在萌发的菌丝边缘进行打孔，然后用接种钩转接到新的PDA平板中，待菌丝长满后将平板4℃保存，即为母种，这里称作第一代菌株，标记为D1。取其中的一个D1平板，在菌丝长满平板之前，沿着菌丝生长方向的最前端，用直径5 mm的打孔器取打孔，然后挑取组织块放置于新的平板一端，组织块要按照菌丝生长的方向放置，最后将平板置于22℃黑暗条件下培养，得到的菌株即为D2。按照以上方法，进行后续的继代培养，直至菌丝死亡，每一次转接即为新的一代，转接要在菌丝长满平板前进行。

1.2.3 不同代数生长速度的测定每隔24 h，以接种的组织块生长边缘为起点，用刻度尺选取3个不同方向，测量菌落的半径，3次的平均值即为菌落半径，并做好数据统记。生长速度（mm/h）=菌落半径（mm）/时间（h）。同时要注意，每次测量都要在菌丝长满平板之前进行。

1.2.4 菌落的形态观察组织块转接到新的PDA平板后，每天做好菌丝浓密度、粗壮度及整齐度的记录，并对10个不同菌株的继代培养菌丝长势进行打分。最后将每个菌株所有代数的长势得分相加，除以代数得到平均值，数值越高，说明菌丝长势越浓密、越粗壮、边缘越整齐。菌丝浓密度分为4个等级：稀疏记0分，较稀疏记1分，较浓密记2分，浓密记3分；菌丝粗壮度分为4个等级：纤细记0分，较纤细记1分，较粗壮记2分，粗壮记3分；整齐度分为4个等级：不整齐记0分，较不整齐记1分，较整齐记2分，整齐记3分。同时，菌株的色素产生情况也要及时做好记录。

2 结果与分析

2.1 不同菌株的继代培养生长速度测定

从图1可以看出，10个菌株继代培养的生长速度均不相同。其中701M1、601M1、601M6、2018LM菌株的生长速度最快，701M4、701M5、72M11菌株的生长速度次之，701M6、73M1、XZ菌株的生长速度最慢。随着连续培养代数的增加，菌丝生长速度呈缓缓下降的趋势，出现小范围升降波动属于正常现象。在培养30代之前，10个菌株均能在4 d内长满平板。30代以后，10个菌株的菌丝生长速度均出现急剧下降，菌丝迅速老化死亡。这与刘伟等[1]报道的高羊肚菌在老化启动阶段其菌丝生长速度与旺盛期无明显变化一致。另外，从生长速度急剧下降的时间来看，2018LM在31代菌丝停止生长，73M1的老化死亡发生最晚，在43代出现。比较而言，“六妹”羊肚菌的老化死亡时间要早于“七妹”羊肚菌和“六妹”与“七妹”融合种，融合种的老化性状更接近于“七妹”羊肚菌，“七妹”羊肚菌最不容易老化。

图1 10个菌株的继代培养生长曲线

2.2 菌落的形态观察

从表2可以看出，根据统计的长势得分值，72M11的菌丝整齐度、菌丝浓密度和粗壮度均为最佳，其次是73M1菌株，701M1、701M5和701M6的菌丝也都较整齐、浓密和粗壮，XZ、2018LM1的菌丝整齐度、浓密度和粗壮度最差。同时，连续培养10代以后，所有菌株均出现菌丝边缘的整齐度下降，主菌丝变纤细且稀疏，次生菌丝减少，逐渐呈现出老化的现象，推测可能菌丝生长已经进入老化启动阶段。另外，分离自同一个菌株子实体的菌丝长势701M1要优于701M4菌株，说明菌丝长势具有个体差异性。

表2 10个菌株在继代培养中的菌丝长势统计 单位：分

另外，本试验发现在继代培养过程中，第2代的701M4、701M6、72M11、73M1、701M5在培养后7 d产生黄褐色的色素，2018LM在培养后10 d产生黄褐色的色素，601M6在培养后14 d产生色素，601M1、XZ、701M1这3个菌株一直未形成色素。培养至第10代时，701M4、701M6、72M11、73M1、701M5于5 d左 右 产 生 色 素，2018LM于7 d左右产生色素，601M6于10 d左右产生色素，601M1、XZ、701M1这3个菌株依然未形成色素，701M5和72M11产生气生菌丝较多。从这里看，随着培养代数的增加，色素产生提前，“六妹”产生色素的时间要晚于“七妹”，但是从生长速度来看，“六妹”的老化却早于“七妹”，推测色素产生和菌株的老化存在一定的关系，但是否有必然的关系，还需要更进一步的数据支持。

3 结论与讨论

菌种的老化会直接影响羊肚菌的产量和品质。在羊肚菌生产中，通过继代培养扩繁母种的现象较为普遍，实验室也经常采用继代培养的方式进行菌种保藏，因此研究继代培养对菌丝老化的影响意义重大。本试验中，10个菌株的羊肚菌在继代培养过程中，均在不同时间出现老化现象，生长速度急剧下降，菌丝变得稀疏、纤细、边缘出现参差不齐，色素产生时间提前。其中，“六妹”羊肚菌2018LM、601M1、601M6的生长速度相对更快，产生色素的时间也晚于“七妹”羊肚菌和融合种，但是菌丝整齐度不如“七妹”羊肚菌，老化时间也比“七妹”羊肚菌和融合种提前，“七妹”羊肚菌的老化死亡时间最晚。从这里看，色素产生提前是菌株进入老化阶段的一个指标，但产生时间的早晚不能直接决定哪个菌株先老化，它们之间不存在正相关关系。相较于钱可晴等[2]报道的15代即老化死亡，本研究中的10个试验菌株均能在30代前保持较快的生长速度，作为优良菌种，都是有潜力的。考量菌种质量好坏的最主要指标是老化时间和菌丝长势，综合所有试验数据，确定“七妹”羊肚菌品种当中72M11和73M1为最佳菌株。下一步将对继代培养的所有菌株进行出菇试验，并结合生产试验，进一步验证最适合推广的优良菌种。