基于TLR3/TRIF通路分析重组人干扰素α2b联合炎琥宁对病毒性肺炎患儿的疗效与作用机制

常 秀，赵 静，侯召权，程 娜

病毒性肺炎(viral pneumonia, VP)是由合胞病毒、流感病毒等感染引起的一种肺部间质性炎症，我国肺部感染疾病中VP发病率占50%，其临床症状主要为咳嗽、发热等，若未及时治疗易引起病情持续性进展，甚至出现咯血等症状[1]。目前临床常采用干扰素、利巴韦林等抗病毒药物治疗VP，但长期使用具有一定不良反应[2]。重组人干扰素α2b是一种广谱抗病毒药物，可与细胞表面膜受体结合，抑制VP相关病毒复制，并调节机体免疫功能，增强巨噬细胞活性[3]。炎琥宁是一种穿心莲内脂提取物，具有抗感染、抗病毒等作用，可抑制毛细血管通透性及病毒复制，增加肾上腺皮质激素释放量，增强巨噬细胞、中性粒细胞吞噬能力，进而抑炎杀菌、减少炎性渗出，减轻机体炎症反应[4]。有研究表明，炎琥宁对VP、肺炎支原体肺炎等具有良好治疗效果，可调节患者机体细胞免疫平衡状态，促进T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖，并灭活呼吸道病毒，减缓气道黏膜炎性损伤[5]。但重组人干扰素α2b联合炎琥宁治疗VP患儿的具体机制尚未明确。体内动物实验研究显示，Toll样受体3(TLR3)/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)通路与VP发生发展密切相关，抑制TLR3/TRIF通路可减轻肺组织损伤[6]。TLR3活化可促进TRIF表达，加快病毒扩散，并促进Ⅰ型干扰素、炎性细胞因子生成，加重肺组织炎性损伤[7]。目前TLR3/TRIF通路与VP患儿之间的关系尚未明确。因此，本研究基于TLR3/TRIF通路，探讨重组人干扰素α2b联合炎琥宁治疗VP患儿的可能作用机制，为VP治疗药物研究提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1—5月我院收治的VP患儿200例，根据治疗方法不同分为对照组和观察组，每组100例。对照组男48例，女52例；年龄1～5(3.01±0.41)岁；病程13～40(29.16±3.15)h；体温38.50～39.60(39.08±0.17)℃；体质量15～20(18.24±0.58)kg；病原分布：EB病毒41例，柯萨奇病毒12例，单纯疱疹病毒11例，腺病毒15例，混合病毒21例。观察组男51例，女49例；年龄1～6(3.05±0.45)岁；病程13～45(30.05±4.08)h；体温38.00～39.70(39.12±0.19)℃；体质量16～21(18.28±0.60)kg；病原分布：EB病毒42例，柯萨奇病毒11例，单纯疱疹病毒13例，腺病毒17例，混合病毒17例。2组上述一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患儿及其家属知情且签署知情同意书。

1.2纳入与排除标准 ①纳入标准：符合VP诊断标准[8]；均有发热、咳嗽、咳痰、呼吸急促甚至呼吸困难等典型肺炎症状；听诊双肺均可闻及湿啰音；肺部X线检查示片状、斑片状浸润性阴影；入院前未接受其他方案治疗；未服用本研究药物或含有本研究药物成分的其他药物；临床病例资料完整。②排除标准：合并心、肝、脾、肺等脏器功能不全者；对本研究药物或其成分过敏者；合并其他急性或慢性感染性疾病者；重症肺炎患儿。

1.3方法

1.3.1治疗方法：2组均给予常规治疗，包括化痰止咳、镇静利尿、解痉平喘等相关药物治疗。对照组在此基础上给予重组人干扰素α2b(长春生物制品研究所有限责任公司，国药准字S20010044，规格：100万单位)治疗，每次10万单位/kg，加0.9%氯化钠注射液至2 ml，雾化吸入，1/d，连续治疗7 d。观察组在对照组基础上给予炎琥宁(西安利君制药有限责任公司，国药准字H20056516，规格：80 mg)治疗，5～10 mg/(kg·d)加入5%葡萄糖注射液100 ml静脉滴注，1/d，连续治疗7 d。

1.3.2采集血液样本：于治疗前后分别采集清晨空腹肘部静脉血6 ml，其中3 ml以4000 r/min离心10 min(离心半径6 cm)，分离血清，置于-80 ℃冰箱待测；另外3 ml血液样本加入等体积淋巴细胞分离液(上海西格生物科技有限公司)，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。

1.3.3PBMC中TLR3、TRIF、核因子-κBp65(NF-κBp65) mRNA表达量：采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测，PBMC中加入1 ml Trizol试剂(美国Invitrogen公司)充分裂解，室温静置5 min后加入氯仿200 μl，12 000 r/min离心10 min后吸取上层无色水相层，加入等体积异丙醇，相同条件下再次离心10 min，弃上清，RNA沉于离心管底部。使用反转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]将RNA反转录合成cDNA。TLR3、TRIF、NF-κBp65引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。qRT-PCR反应体系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O补足反应体系至20 μl；反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s(共循环40次)。应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪进行扩增，以GAPDH为参照，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 TLR3、TRIF、NF-κBp65引物序列

1.3.4血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平：采用免疫散射比浊法检测血清IgG、IgA、IgM水平，检测试剂盒由上海一研生物科技有限公司提供。

1.4观察指标 ①比较2组临床疗效[9]，痊愈为患儿高热、咳嗽、喘息、肺部啰音等症状消失，胸部X线片恢复正常；有效为患儿咳嗽、喘息、肺部啰音等症状明显改善，体温恢复正常，胸部X线片恢复正常；无效为患儿体温、咳嗽、喘息、肺部啰音等症状无改变，胸部X线片无改变。总有效率=(痊愈+有效)/总例数×100%。②比较2组临床症状改善时间及住院时间，临床症状改善时间包括退热时间、咳嗽消失时间、呼吸困难消失时间、肺啰音消失时间。③比较2组治疗前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量。④比较2组治疗前后血清IgG、IgA、IgM水平。⑤比较2组治疗前后呼吸功能，使用Jaeger肺功能仪(上海聚慕医疗器械有限公司)检测呼吸频率(RR)、潮气量(VT)、呼气达峰时间(TPTEF)/呼气时间(TE)。⑥比较2组不良反应发生情况，包括声嘶、恶心呕吐、腹泻、皮疹。

2 结果

2.1临床疗效比较 观察组临床总有效率高于对照组(P<0.01)。见表2。

表2 2组病毒性肺炎患儿临床疗效比较[例(%)]

2.2临床症状改善时间及住院时间比较 观察组退热时间、咳嗽消失时间、呼吸困难消失时间、肺啰音消失时间及住院时间均短于对照组(P<0.01)。见表3。

表3 2组病毒性肺炎患儿临床症状改善时间及住院时间比较

2.3治疗前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量比较 治疗前，2组PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗7 d后，2组PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量较治疗前下降，且观察组低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 2组病毒性肺炎患儿治疗前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量比较

2.4治疗前后血清免疫球蛋白水平比较 治疗前，2组血清IgG、IgA、IgM水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗7 d后，2组血清IgG、IgA、IgM水平较治疗前升高，且观察组高于对照组(P<0.05)。见表5。

表5 2组病毒性肺炎患儿治疗前后血清免疫球蛋白水平比较

2.5治疗前后呼吸功能比较 治疗前，2组RR、VT、TPTEF/TE比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗7 d后，2组RR较治疗前下降，VT、TPTEF/TE较治疗前升高；且观察组RR低于对照组，VT、TPTEF/TE高于对照组(P<0.05)。见表6。

表6 2组病毒性肺炎患儿治疗前后呼吸功能比较

2.6不良反应发生情况比较 2组不良反应总发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 2组病毒性肺炎患儿不良反应发生情况比较[例(%)]

3 讨论

病毒侵袭下呼吸道可引起呼吸道上皮、黏膜损伤，促使气管、支气管黏膜水肿，降低呼吸道防御功能，同时随着炎性渗出、炎性细胞浸润导致呼吸道管腔阻塞，炎性介质进入肺间质，进而促进VP发生发展[10-11]。

重组人干扰素α2b具有疗效确切、靶向性强等特点，可抑制多种病毒合成，研究表明干扰素α2b可提高病变部位抗病毒感染能力，增强机体免疫功能，并通过干预T淋巴细胞等因子表达，降低机体炎性细胞浸润[12]。炎琥宁还可抑制宿主细胞中病毒复制，抑制流感病毒神经氨酸酶，提高机体免疫球蛋白水平，并能抑制单核细胞、中性粒细胞所致呼吸道炎症反应[13]。炎琥宁还可抑制白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性细胞因子生成，调节T淋巴细胞亚群水平，提升细胞免疫功能[14]。本研究显示，观察组临床总有效率高于对照组，且临床症状改善时间、住院时间短于对照组，表明相较于单独使用重组人干扰素α2b，联合炎琥宁治疗可提高VP患儿治疗效果，改善临床症状。外源性给予重组人干扰素α2b可增强VP患儿抗病毒感染能力，联合炎琥宁治疗可发挥协同作用，增强患儿免疫功能，减轻炎症反应程度，减缓病情发展进程。免疫球蛋白合成、释放有利于灭活病毒，IgG、IgA、IgM分布于呼吸道上皮、黏膜，可中和病毒，降低感染发生风险，VP患儿早期存在体液免疫紊乱情况，免疫球蛋白水平可反映机体免疫功能，若IgG、IgM水平降低表明病毒尚未完全清除[15]。本研究显示，治疗7 d后，观察组血清IgG、IgA、IgM水平高于对照组，表明联合治疗清除病毒能力强于单独使用重组人干扰素α2b。同时本研究发现，治疗7 d后，观察组RR低于对照组，VT、TPTEF/TE高于对照组。重组人干扰素α2b可产生抗病毒蛋白，刺激免疫细胞，增强机体杀伤病毒能力，并能改善患儿气道功能[16]。炎琥宁可进一步降低炎性因子水平，缓解呼吸道症状，进而改善肺功能[17]。结合本研究结果可知联合治疗可调节T淋巴细胞等免疫细胞水平，增强抗病毒能力，有利于及时清除感染，减轻炎症反应，进而提升VP患儿呼吸功能。同时本研究发现联合治疗后不良反应总发生率并未明显增加，提示联合治疗安全性高。

TLR可识别病毒相关分子，并能激活细胞内相关信号转导途径，促进特异性基因、趋化因子表达。有研究表明，调节TLR3信号通路可能成为治疗炎性疾病的新靶点，TLR3仅募集接头蛋白TRIF，可通过TRIF激活下游炎性细胞因子[18]。TRIF还可激活NF-κB信号途径，NF-κB与IκB结合形成p50-p65-IκB三聚体，以无活性状态存在，病毒感染后IκB磷酸化促使三聚体分离，促使NF-κBp65形成，NF-κBp65可促进IL-6、TNF-α等炎性因子表达，促使单核细胞浸润，进而促进间质性肺炎产生。另外抑制IL-6、TNF-α表达可降低该信号转导途径活化程度，进而发挥抗病毒感染作用[19]。本研究显示，治疗7 d后，观察组PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量低于对照组，这可能是通过抑制TLR3/TRIF通路，降低炎性因子释放，促进抗病毒因子合成，而发挥治疗VP作用。抑制TLR3表达可增强肺泡巨噬细胞极化、杀菌活性及吞噬能力，并能改善气道功能和肺功能[20]。这就表明通过抑制TLR3/TRIF通路活化，可改善VP患儿呼吸功能。有研究表明，TLR2、TLR4、TLR3表达上调可抑制IgA分泌，进而加重肺组织炎性损伤[21]。揭示了TLR3/TRIF通路活化可调节VP患儿血清免疫球蛋白水平。TLR3在巨噬细胞等免疫细胞中诱导炎症反应，促进NF-κB通路相关蛋白表达，故抑制其活性可发挥抗病毒作用，并可能作为治疗病毒感染相关疾病的潜在靶基因[22]。炎琥宁成分中穿心莲可活血消肿、润肺止咳，可上调IgG、IgA、IgM水平，提升机体免疫能力，并降低炎性因子相关通路活性，进而减轻气道炎症反应，改善患者肺功能[23]。由此推测炎琥宁可能通过抑制TLR3/TRIF通路，提升VP患儿血清IgG、IgA、IgM水平，改善其呼吸功能，进而发挥抗病毒感染作用，进一步提高临床疗效。

综上所述，重组人干扰素α2b联合炎琥宁在VP患儿中的疗效确切，不良反应少，并可改善临床症状和呼吸功能，提升免疫球蛋白水平，其抗病毒机制可能与抑制TLR3/TRIF通路活化有关。