真菌性角膜炎继发感染性眼内炎行眼内容物剜除术的临床特点及病原学分析

朱雪靓 毛慧琳 张晓玉 李晓凤 鹿秀海 亓晓琳

作者单位：1青岛大学医学部，青岛 266071；2山东第一医科大学附属眼科研究所 山东第一医科大学附属眼科医院（山东省眼科医院）山东省眼科学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地 山东第一医科大学眼科学院，济南 250021

真菌性角膜炎是我国常见的致盲性眼病,主要致病菌包括丝状菌、酵母菌等近百种真菌[1-2]。但是用于眼局部的抗真菌药物种类较少，主要为多烯类和唑类等，并且是抑菌剂，在角膜组织中的穿透力差[3]。当感染的真菌菌种毒力强、药物敏感性差，容易导致病情迁延难愈，一旦真菌感染累及全周角膜缘，并深达全层，会继发前房、晶状体及玻璃体等眼内组织感染，仅通过角膜移植手术难以控制病情进展。当视功能受损严重、视力逐渐丧失，不得不行眼内容物剜除术，这对患者的外表及身心健康造成不可避免的负面影响。本研究分析了本院真菌性角膜炎继发感染性眼内炎患者的临床特征及病原学特点，旨在为真菌性角膜炎患者的早期干预治疗提供参考依据，从而避免眼球丧失的不良结局。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入标准：（1）患者经实验室诊断为真菌性角膜炎（满足以下其一即可）：①角膜刮片细胞学检查（氢氧化钾湿片真菌镜检法）可见真菌菌丝；②共聚焦显微镜检查可见真菌菌丝；③微生物培养有真菌生长；④病理切片PAS染色可见真菌菌丝。（2）抗真菌药物治疗后病情未见缓解或逐渐加重，经裂隙灯显微镜及B超检查诊断为感染性眼内炎：裂隙灯显微镜检查发现角膜水肿，前房渗出或积脓，晶状体表面渗出物沉积，玻璃体呈灰白色颗粒状混浊或形成玻璃体脓肿，瞳孔区呈灰白或黄白色反光，眼底模糊不清，不能窥见眼底红光反射等；B超提示玻璃体混浊或炎症。（3）视力为无光感，各方向光定位及红绿色觉消失。视觉诱发电位（VEP）检查未引出明显波形。

回顾性系列病例研究。收集2012年1月至2021年12 月于山东省眼科医院因真菌性角膜炎继发感染性眼内炎行眼内容物剜除术的所有患者资料44例（44眼），其中男27例（27眼），女17例（17眼）；年龄36～76（58.3±9.7）岁。35例（80%）患者职业为农民，7 例（16%）为工人，2 例（5%）为无业人员。本研究遵循赫尔辛基宣言，研究方案经山东第一医科大学附属眼科医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：SDSYKYY20201105）。

1.2 检查方法

1.2.1 裂隙灯显微镜检查 检查角膜溃疡的位置、大小、形状、深度等特征，以及用药后感染控制情况；角膜OCT检查判断溃疡深度；角膜刮片及共聚焦显微镜检查有无菌丝、阿米巴包囊等。

1.2.2 角膜刮片微生物检测 严格无菌操作下，表面麻醉后首先用消毒刀片去除角膜溃疡表面坏死组织，然后在溃疡边缘及基底部刮取病变组织，分别涂片行Gram染色及10%氢氧化钾湿片镜检或角膜荧光染色，同时刮取病变组织分别接种到血平板培养基及沙堡弱培养基中，用无菌拭子拭抹溃疡底部及边缘部分，放入肉汤中增菌培养，鉴定细菌、真菌种类并行药物敏感试验。药敏试验采用美国临床和实验室标准化协会制定的微量稀释法（M-38A方案）进行实验。先将相应培养基上的真菌菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在35℃下培养7 d后，在培养基上滴入2 ml的0.9%氯化钠溶液，将含有菌株的0.9%氯化钠溶液转入无菌的玻璃试管中。调整菌液浓度为（0.5～5）×104cfu/ml。96孔板加入10级倍比稀释的抗真菌药物（两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、氟康唑、阿尼芬净、米卡芬净、卡泊芬净）。每孔加入100 μl的菌液后进行孵育，曲霉、镰刀菌、帚枝霉和单孢瓶霉应在35℃孵育48 h，赛多孢霉、链格孢霉及无孢霉应在28℃孵育72 h后读取最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。棘白菌素的最低有效浓度在孵育24 h后读取。MIC值终点判定采用M-38A方案，用近平滑念珠菌ATCC22019作为质控菌株。

1.2.3 共焦激光显微镜检查 表面麻醉后，嘱患者固定前额及下颌，在显微镜物镜上涂抹医用凝胶并调整显微镜参数，按角膜上皮层至内皮层的顺序依次扫描，并记录图像。

1.3 治疗方法

所有患者均给予全身及局部抗真菌药物治疗，全身用药为氟康唑氯化钠注射液，0.2 g/100 ml每日1 次，静脉滴注，首日剂量加倍；氟康唑滴眼液或10 mg/ml伏立康唑滴眼液每30分钟1次，0.25%那他霉素滴眼液每小时1次交替点眼，根据药敏结果随时调整局部用药方案。此外，加替沙星滴眼液每2小时1次，晚上睡前应用加替沙星凝胶。

2 结果

2.1 一般情况

2012 年1 月至2021 年12 月山东省眼科医院诊断为真菌性角膜炎的患者总数为2043例（2043眼），同期因真菌性角膜炎继发感染性眼内炎而行眼内容物剜除术的患者共44例，所占比例为2.15%。两者每年病例数变化见图1。

2.2 病史情况

2.2.1 发病诱因 10眼（23%）发病前有泥土、铁质异物、飞尘等异物入眼史；10眼（23%）有玉米叶或树枝划伤等植物外伤史；其他24眼（55%）无明显发病诱因。此外，6眼（14%）发病前有妥布霉素地塞米松眼膏使用史。

2.2.2 病程 自本次出现症状至就诊的时间为10～150 d，中位数18.5 d，其中10～30 d 27眼（61%），30～60 d 15眼（34%）、＞60 d 2眼（5%）。

对患者生活方式改善、自我血糖监测、血糖控制情况进行观察记录；并对患者治疗前后空腹血糖及糖化血红蛋白进行测量；采取问卷调查表，对患者护理前后糖尿病知识掌握情况进行调查，该调查表总分为100分，分数越高，则表示患者知识掌握度越好；

2.2.3 全身及其他眼部病史 9例（20%）合并全身疾病，其中5例为Ⅱ型糖尿病、3例为甲状腺功能亢进、1例为慢性乙型肝炎。7例患者（16%）既往行过患眼手术治疗，其中4例为抗青光眼手术（3例为发病前3年、1例为发病前1个月），1例为白内障手术（发病前5年），1例为玻璃体切割术（发病前3个月），1例为穿透性角膜移植术（发病前1个月）。

2.3 临床特点

入院时44 眼视力均为无光感。眼压6～44（20.1±9.0）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），其中20 眼（45%）合并继发性青光眼，眼压22～44（30.2±5.8）mmHg。

图1.2012至2021年真菌性角膜炎和真菌性角膜炎继发感染性眼内炎行眼内容物剜除术患者例数变化Figure 1. Changes in the number of patients with fungal keratitis and fungal keratitis secondary to infectious endophthalmitis undergoing evisceration of ocular contents from 2012 to 2021

44 眼均为全角膜溃疡，并累及部分或全周角膜缘处，同时所有患者溃疡深度达角膜全层，内皮面附着黄白色黏稠脓性渗出物，3 眼（7%）入院时溃疡已穿孔。27 眼（61%）合并前房积脓，其中15眼积脓深度<3 mm，7眼积脓深度3～5 mm，5眼积脓深度>5 mm，角膜溃疡特征见图2。42眼B超检查结果均显示玻璃体弥漫性或团块状混浊，2眼外伤后行玻璃体切割硅油填充术。

图2.真菌性角膜炎继发感染性眼内炎患者角膜溃疡特征A：右眼玉米粒崩伤后眼红、黑睛发白25 d，裂隙灯显微镜检查显示全角膜溃疡，溃疡侵及全周角膜缘处(见箭头)，同时累及角膜全层，前房可见7 mm积脓；B：右眼眼红、眼痛伴视力下降20 d，裂隙灯显微镜检查显示全角膜溃疡，并侵及角膜缘，中下方溃疡灶累及角膜全层，内皮面及晶状体表面可见大量黄白色积脓（见箭头）；C：左眼树叶划伤后眼红、眼痛伴视力下降18 d，裂隙灯显微镜检查显示全角膜溃疡，溃疡侵及全周角膜缘处，前房可见4 mm积脓（见箭头）Figure 2.Typical signs of patients with fungal keratitis secondary to infectious endophthalmitisA: After the corn kernel collapse injury of the right eye,the eye was red and black turned white for 25 days.Under the slit lamp examination,his ocular signs showed a total corneal ulcer,which invaded the limbus (arrow) and infiltrated the whole layer of the cornea,and 7 mm empyema could be seen in the anterior chamber.B: One patient had red eye pain for 20 days with decreased visual acuity.The slit lamp examination showed total corneal ulcer,which invaded the limbus and the middle and lower ulcer focus infiltrated the whole layer of the cornea.In addition,a large number of yellowish white empyema can be seen on the inner surface of the cornea and the surface of the lens (arrow).C: A patient's eye was pain and red with decreased visual acuity because he was scratched by a branch.After 18 days,his ocular signs showed a total corneal ulcer under the slit lamp examination,which invaded the limbus,and 4 mm empyema could be seen in the anterior chamber (arrow).

2.4 病原学检查及药物敏感试验结果

2.4.1 病原学检查 角膜刮片检查中，44眼均可见丝状菌。除3 眼已穿孔，其余41 眼通过共聚焦显微镜可查见丝状菌丝，菌丝分布较为密集，直径2.3～4.4 μm，长度200～400 μm，菌丝呈高折光性，伴有分支和中隔；其中11眼可观察到菌丝突破后弹力层到达内皮层，见图3。

图3.真菌性角膜炎继发感染性眼内炎行眼内容物剜除术眼角膜刮片检查A、B:菌丝量多密集，侵蚀角膜，病灶处无正常角膜结构，部分可查见大量孢子；C：菌丝浸润深达内皮层，内皮结构不清Figure 3.The corneal scrape examination of eyes with fungal keratitis secondary to infectious endophthalmitis underwent eviscerationA,B: The hyphae were dense and eroded the cornea.There was no normal corneal structure at the focus,and numerous spores could be found in some parts.C:The hyphae reached to endodermis,and the endothelial structure was unclear.

2.4.2 微生物培养结果 共39眼微生物培养见真菌生长，阳性率为89%，其中镰刀菌属20眼（占51%，包括茄病镰刀菌复合群15眼、藤仓镰刀菌复合群5眼）；曲霉菌属8眼（21%，全部为黄曲霉复合群）；链格孢霉属2 眼（5%）；其他菌属9 眼包括无孢霉4 眼（10%），谲诈腐霉菌2眼（5%），尖端赛多孢霉1眼（3%），帚枝霉1眼（3%），多毛拟单孢瓶霉1眼（3%）。见图4。

图4.少见菌种在培养基中的形态特点A：无孢霉，沙堡弱培养基中呈现茶藨子葡萄座腔菌；B：谲诈腐霉菌，水草培养基中可见游动的孢子；C：尖端赛多孢霉，菌丝较粗，并伴有球形子囊果；D：陆生帚枝霉，分生孢子排列成链状Figure 4.Rare species in their culture mediumA: Sarcophagus Scirpus on Sabouraud medium.B: Swimming spores produced by Pythium insidiosum in aquatic medium.C: The hypha of Scedosporium apiospemum were thick with spherical spores on Sabouraud medium.D: The conidia of Terrestrial Sarocladium arranged in chains on Sabouraud medium.

2012年1月至2021年12月期间山东省眼科医院收治真菌性角膜炎患者共计2043例（2043眼），其中真菌菌属眼数分布为：镰刀菌属941眼（46.06%，包括茄病镰刀菌复合群489眼，藤仓镰刀菌复合群71眼）；曲霉菌属452眼（22.13%，包括黄曲霉367眼）；链格孢霉属275眼（13.46%），无孢霉45眼（2.20%），帚枝霉19眼（0.93%），尖端赛多孢霉11眼（0.54%），谲诈腐霉菌9眼（0.44%）。

本研究培养的菌种对两性霉素B、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、氟康唑、阿尼芬净、米卡芬净、卡泊芬净的MIC值的几何均数依次为1.597、1.338、1.926、3.291、64、189.699、1.36、1.16、1.23 μg/ml。镰刀菌属依次为1.414、4.595、4.438、16、64、256、8、8、8 μg/ml；曲霉菌属依次为1.542、0.085、0.354、0.111、64、165.995、0.015、0.009、0.009 μg/ml；链格孢霉依次为1、0.354、2.828、0.354、64、32、0.015、0.015、0.03 μg/ml；无孢霉依次为2.378、1.682、1.414、4.757、64、256、8、8、8 μg/ml：尖端赛多孢霉依次为8、1、0.5、1、64、32、4、0.12、0.5 μg/ml。

3 讨论

真菌性角膜炎作为常见的感染性角膜炎，大部分患者通过抗真菌药物治疗，同时联合角膜病灶切除术[4]、角膜基质注药术[5]以及角膜移植术[6]，达到控制感染、保留眼球的治疗效果。但是仍有部分全角膜真菌感染并累及眼内睫状体、玻璃体的患者，视功能逐渐丧失，为避免感染扩散不得不采取眼内容物剜除手术[1-2]。本研究收集了我院因真菌性角膜炎继发感染性眼内炎而最终行眼内容物剜除术的44 例患者资料，这些患者占同期我院真菌性角膜炎患者总例数的2.15%。国外1项统计推测全球至少有8%～10%真菌性角膜炎患者不得不摘除眼球[2]，严重破坏了患者的双眼视功能及外观。因此为了进一步降低眼球丧失率，本研究重点分析了上述患者的眼部体征和病原学特点，希望为临床诊疗提供参考和借鉴。

本研究中27 例（61%）患者发病病程局限在1个月内，病程中位数为18.5 d。44例患者就诊时均表现为全角膜溃疡，并累及角膜缘处，同时所有患者溃疡深度达角膜全层，27眼（61%）伴有前房积脓，3眼（7%）合并穿孔，20眼(45%)合并继发性青光眼。超声检查显示42 眼患者玻璃体呈弥漫性或团块状混浊。此外6眼(14%)患者发病前有典必殊眼膏使用史，9眼（20%）患者既往行抗青光眼、玻璃体切割等手术治疗。由此可见真菌性角膜炎继发感染性眼内炎的患者具有起病急、进展迅速、眼部抵抗力差、炎症反应重、预后差等特点，从而提示我们一旦遇到全角膜溃疡的患者需要引起高度重视，仔细询问病史，并给予全面详细的眼部检查，做到快速诊断和有效治疗。

我国真菌性角膜炎致病菌排名前3位依次为镰刀菌属、链格孢菌属、曲霉菌属[7-9]。本研究共39眼微生物培养示真菌生长，前3位分别为镰刀菌属（20眼，51%）、曲霉菌属（8眼，21%）、链格孢霉属（2眼，5%），与我院同期2043例真菌性角膜炎患者的菌种分布相一致。但是对比分析两者之间的菌种占比，发现存在以下三处差异：首先，两者藤仓镰刀菌复合群的占比不同，镰刀菌属主要分为茄病镰刀菌复合群和藤仓镰刀菌复合群，由玉米损伤所致真菌性角膜炎患者中藤仓镰刀菌复合群发病率高于茄病镰刀菌[10-11]，且分离出的轮枝镰刀菌种（属于藤仓镰刀菌复合群）致病力更强[12]。同期真菌性角膜炎患者中藤仓镰刀菌复合群占比为3.48%，而在眼内容物剜除术患者中占比上升至12.82%。其次，两者链格孢霉属的占比不同，链格孢霉属的特点是致病力弱、预后佳，同期真菌性角膜炎患者中占比为13.46%（275例），与我国学者研究报道基本一致[7,13]，但在眼内容物剜除术患者中占比明显下降，仅为5.13%（2 例）。最后，两者少见菌属的占比不同，本研究中少见致病菌属如无孢霉（4眼，10.26%），谲诈腐霉菌（2眼，5.13%），尖端赛多孢霉（1眼，2.56%）等的共性是致病侵袭力强、对抗真菌药物敏感性差，手术治疗作为首选的治疗方式，但术后真菌复发率高、预后差[14-17]，它们所占比例均高于同期真菌性角膜炎患者的占比。因此我们发现与同期真菌性角膜炎患者相比，继发感染性眼内炎的患者中链格孢霉属等致病力弱的菌种有所减少，而藤仓镰刀菌复合群、无孢霉、谲诈腐霉菌等致病力强、药物敏感性差的菌种明显增加，从而导致患者病情难以控制，不得不行眼内容物剜除术。

本研究中真菌培养呈阳性的镰刀菌属、曲霉菌属、链格孢霉属，以及其他罕见菌属如无孢霉、尖端赛多孢霉、帚枝霉等对伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B的MIC值较低，而对氟康唑、5-氟胞嘧啶的MIC值较高，与之前的研究结果相一致[12,18-21]，可用以指导临床一线用药。当真菌培养结果为无孢霉、尖端赛多孢霉或帚枝霉，可以优先选择MIC值较低的药物如伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B等。谲诈腐霉菌细胞壁缺少麦角固醇结构，而麦角固醇是多烯类和唑类抗真菌药物的作用靶点，故临床常用的抗真菌药物对其效果较差，需要尽快采取角膜移植手术治疗[21-22]。但是真菌种类纷繁复杂，对各种抗真菌药物的敏感性各有差异。例如镰刀菌属可分离出7个复合群[23]，其中最常见的茄病镰刀菌复合群对两性霉素B的MIC值低于藤仓镰刀菌复合群，而对伏立康唑、泊沙康唑的MIC值却高于藤仓镰刀菌复合群，因此提示我们要尽快完成微生物培养鉴定，并根据药物敏感试验结果调整临床用药。

本研究重点总结了真菌性角膜炎继发感染性眼内炎行眼内容物剜除术患者的临床特征及病原学特点，患者起病急、病情进展迅速，眼部表现为全角膜溃疡，并累及角膜全层及角膜缘处，多伴有前房积脓和继发性眼压升高。微生物培养结果显示前3位致病菌分别为镰刀菌属、曲霉菌属、链格孢霉属，但其他致病力强、药物敏感性差的少见菌属如无孢霉、谲诈腐霉菌、尖端赛多孢霉等所占比例跟我院同期2043例真菌性角膜炎患者相比有一定升高。药物敏感试验显示对伏立康唑、泊沙康唑、两性霉素B的MIC值较低，而对氟康唑、5-氟胞嘧啶的MIC值较高。因此对于临床上表现为全角膜溃疡的真菌性角膜炎患者应提高警惕，应用广谱抗真菌药物治疗的同时尽快进行微生物培养明确菌种，并及时根据药敏结果调整敏感药物进行治疗。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明朱雪靓：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释，撰写论文，对编辑部的修改意见进行修改。毛慧琳、张晓玉、李晓凤、鹿秀海：参与资料采集，修改论文的结果。亓晓琳：主要手术者，参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，对编辑部的修改意见进行核修