脱细胞骨基质复合材料的研究进展

孙佳培，彭 伟，西 娜，谢聪钦

1.中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部派驻第八医学中心，北京 100091; 2.中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部关节外科，北京 100048； 3.河北北方学院，河北 张家口 076250； 4.中国人民解放军总医院医疗保障中心药剂科，北京 100853

道路交通伤、工伤、军事训练伤等直接和间接暴力因素均会导致骨缺损。调查结果显示，骨折不愈合和骨缺损是骨科创伤中最具挑战性的临床问题之一，骨折后骨不连或骨缺损的发生率逐渐增加[1]。研究表明免疫排斥导致骨移植物的不愈合、延迟愈合和成骨脆弱是多种移植方式失败的首要原因，失败率在10%～50%[2]。脱细胞骨基质(aceller bone matrix,ACBM)作为骨组织工程领域中少数保留骨小梁等自体骨结构的同时又具有天然孔隙率、去除免疫原性的支架材料，本身具备其他材料没有的优势。去除细胞成分的ACBM主要成分是无机物和胶原[3]，在未来骨缺损修复研究领域具有较好的发展前景。近三十年，人们不断地尝试采用不同的技术和方法将具有各自特性的物质元素与ACBM相复合，有效地改善单一材料诱导成骨能力差、复合材料强度低和骨细胞增殖分化缓慢等缺点，制成多功能复合材料应用于骨缺损临床治疗，推进了修复骨缺损研究的进展。

ACBM复合材料满足理想骨移植物四项基本条件[4]:(1)弹性模量和正常组织接近，避免骨折和应力遮挡;(2)骨传导、骨诱导和组织相容性好，有利于骨愈合；(3)能够逐渐降解和吸收，并被正常骨组织替代；(4)移植物低免疫原性，不与宿主发生免疫排斥反应。排除传统的骨移植方式，骨组织工程ACBM材料具有良好生物性能和理化性能，能保持骨骼结构完整、机械力学性质稳定并降低骨抗原性。本综述对近几年ACBM复合材料的代表性研究进行分类回顾，列举相应的临床实验，并根据目前的研究发展对ACBM复合材料的研究方向进行综述。

1 ACBM与有机骨材料复合

有机骨材料主要包括高分子材料和复合材料，高分子材料分为天然和人工合成材料，ACBM与高分子材料复合形成新型骨缺损修复材料，具有来源广泛易获取、方便加工、性质稳定、降解周期可以调节等特性，研究发现新型材料具备良好的成骨效应和生物相容性，能够达到骨组织工程对骨修复的要求[5]。

1.1ACBM与壳聚糖(chitosan，CS)复合 CS是壳质的N-去乙酰化产物，是一种类似纤维样的热塑性聚合物，可被壳聚糖酶和氨基葡萄糖酶降解为葡萄糖。在过去的几十年里，CS因其生物相容性、生物降解性、低毒性和与细胞外基质的相似性而在骨组织工程中引起广泛的关注[6]，有利于新骨形成后复合材料的降解。刘昊[7]运用联合脱细胞方法处理猪股骨干获得ACBM，定性分析之后，采用冷冻干燥法和溶液共混制得ACBM-壳聚糖(ACBM-CS)支架，并对复合支架的组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率、力学性能等进行分析，结果表明，实验组数据均在理想范围，符合构建工程骨复合材料的基本条件，满足人工骨移植治疗的要求。对复合材料进行热原试验、细胞毒性试验和细胞-支架粘附复合培养显示材料具有良好的生物相容性，支架细胞长势良好，能够在短时间内诱导新骨形成。因此ACBM-CS复合材料拥有良好的骨缺损修复潜力。

1.2ACBM同RGD肽复合 RGD肽别名精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，广泛存在于细胞外基质蛋白中，如纤维连接蛋白、玻璃体蛋白、骨桥蛋白和骨涎蛋白。可以与整合素细胞表面受体相互作用，启动细胞黏附和细胞扩散。在骨组织工程应用中，研究表明RGD序列表面修饰能增强骨髓基质细胞黏附，促进体外成骨细胞分化，在体内刺激骨形成[8]。Zhang等[9]在ACBM-RGD肽支架上接种骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)，利用RGD肽能够提高间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的黏附率的特性，观察通过RGD 肽表面修饰的 ACBM 是否促进了组织工程骨的生长效率。通过一系列实验室操作将RGD肽共价偶联到ACBM支架上，暴露的天冬氨酸和谷氨酸的羧基团用适当体积的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(NHS)激活并在室温磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)中溶解15min，抗黏附多肽(GRGDS)在室温PBS中孵育2h，并在风干之前彻底冲洗ACBM支架盘以去除多余的EDC/NHS，通过以上操作调整表面RGD适宜的浓度。利用流式技术对接种到ACBM-RGD肽支架和天然ACBM支架表面的 MSCs的细胞附着进行量化， 结果显示，在 3 、6 、12h，ACBM-RGD肽支架上黏附的MSCs的百分比分别是天然ACBM支架上的1.23、2.74和2.17倍,并且原生ACBM支架上的MSCs基本是球形且分布较少，相较于RGD肽修饰的ACBM支架上细胞分布广泛。对RGD肽共价偶联的ACBM支架进一步分析，结果表明RGD肽共价偶联对ACBM支架进行的是有效修饰，促进了MSC的初始附着、扩散和黏附形成。同时RGD序列促进了骨化信号转导通路的启动，导致MSC增殖增加。由此可见，用RGD肽修饰功能性ACBM可以有效地促进MSCs在ACBM上的黏附，从而达到促进成骨作用，是改善最终细胞-材料相互作用的可行方法，可作为组织工程骨在临床应用中的新思路进一步探索。

2 ACBM与无机金属材料复合

无机材料种类丰富，生物学性能多样，和ACBM复合的无机材料可以概括为以下几类：生物陶瓷(如β-磷酸三钙 β-TCP、多晶氧化铝、单晶氧化铝等)，碳基材料(如石墨碳、碳纳米管、玻璃碳、介孔二氧化硅)，金属(如Sr、Zn、Mg、Ai)，金属氧化物(如Fe3O4、TiO2、Na2O等)，非金属(如C、F、Si)等。研究发现，将ACBM与无机材料复合，可以进一步增强ACBM的机械性能，赋予新的促成骨效应。

2.1ACBM与镁合成复合材料 ACBM与镁形成的复合材料除了具备ACBM硬度高的优点，研究表明，Mg2+对骨修复的初始促成骨益处可以超越其负面影响，一方面增强成骨细胞作用，另一方面降低破骨细胞活动[10-12]，并且微环境中Mg2+的浓度越高，对原位骨再生的促进能力也越强，功能原理主要是通过刺激成骨细胞分化和BMSC的增殖[13]。同样要注意纯镁材料的缺点是在体内快速降解，会导致与新骨的形成过程不匹配[14]。利用镁离子这一特性，李彪等[15]制备出添加镁离子的脱细胞牛骨基质(acellular bovine bone matrix，ABBM)复合材料。首先剔除软组织的新鲜牛股骨，采用高速切割机切割获得小立方体状骨松质，经过高压水枪去除血液以及骨髓后置于-80℃下、70℃超声振荡等处理，清洗后置于冷冻干燥机进行冻干。最后浸泡在含镁溶液中，灭菌后得到复合了镁离子的ABBM。对ABBM-Mg复合材料的性能进行检测，X射线衍射分析表明浸泡镁离子溶液后ABBM中的成分分布有所差别，主要成分是羟基磷灰石，和Ofudje等[16]及Predoi等[17]的实验结论相同；扫描电镜和能谱仪观察对比ABBM微细结构、抗压强度、三维孔隙结构等发现复合前后并未有明显改变，即复合材料前ACBM所具有的成骨优点仍然存在，材料中的Mg2+在体外缓慢释放，维持了微环境Mg2+浓度的稳定，有助于持续稳定发挥促成骨作用。研究表明，镁离子结合ABBM所形成的复合材料可以有效促进BMSC的增殖，解决了ABBM单个材料骨诱导性低的缺陷，为无机金属材料参与骨缺损复合材料的制备开辟了良好开端。

2.2ACBM与锶(Sr)合成复合材料 在过去几十年中，各种生物活性因子已被认为具有改善生物医学材料生物性能和治疗的潜力，尤其是在混合和无机材料领域。这些存在人体中的生物活性因子，因为化学稳定性和低成本性而吸引人们进一步探索。微量元素锶具有骨跟踪特性，在骨消化及代谢上具有双重效果：一方面促进骨祖细胞的分化增殖，另一方面阻止破骨细胞的终末分化。动物模型实验发现，锶可以增加新骨形成[18-20]，并有实验表明，掺入Sr的Ca-Si基生物陶瓷(MSCs)支架可以提高骨质疏松性骨间充质干细胞(OVX BMSCs)的成骨和血管生成标志物的表达水平[21]，同样经锶掺杂处理后，ACBM的生物活性和矿物沉积速率也有所提高[22]。

Huang等[23]基于锶元素通过离子交换掺入十分耗时的特性，考虑到复杂的骨组织结构和苛刻的装饰条件(如高温、酸性pH下，生物化学成分尤其是生长因子和羟基磷灰石容易被破坏)，开发了一种简单易行的涂装方法，用于在温和条件下进行ACBM表面装饰。羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)是一种具有良好生物相容性、优异的亲和性和较强的离子螯合能力的阴离子多糖。研究表明，CMC不会对骨植入物的骨诱导性产生不利影响[24-25]。另一物质多巴胺(dopamine，DOPA)同样具有良好的生物相容性和良好的粘附能力，被认为是生物材料表面修饰的理想黏附分子[26]。将Sr在温和条件下同CMC和DOPA合成有机涂层复合材料CMC-DOPA-Sr，ACBM浸入DOPA溶液，然后在真空炉(中国上海跃进)中干燥，将聚多巴薄膜涂覆到ACBM涂层表面，最终获得ACBM-Sr复合支架，两者的结合弥补了ACBM作为骨缺损修复支架的低成骨诱导性。利用ICP-OES光谱法(Vista-MPX，USA)测量发现ACBM-Sr支架表现出持续的锶离子释放曲线，保证了治疗环境中持续稳定的锶离子环境。此外，将复合支架材料植入小鼠皮下模型中组织相容性良好，未发生排斥反应。支架组织学染色显示，所有支架的大孔中均发现丰富的纤维结缔组织。生长培养基培养细胞时，测定人BM-MSCs的成骨基因表达情况， ACBM-Sr涂层组较ACBM相比，包括Runx2、骨保护素和骨桥蛋白在内的成骨基因的表达显著增加。这些结果表明，ACBM-Sr支架促进体外成骨分化，为ACBM可复合多种材料提供了一种简单而温和的可行性方案，针对具有复杂结构和易损部位的修复提供了新的选择。

3 ACBM与组织细胞联合形成的骨材料

骨组织工程主要分为三部分：种子细胞、复合支架和生长活性调节因子。种子细胞在组织工程中的作用位居首位，一般来说，具有免疫反应弱、增值能力强、抗原性低、分化潜能大等特点，最重要的是能够建立稳定的细胞系[27]。不同种子细胞和ACBM结合后形成的支架材料特点具有多样性。

3.1ACBM与诱导成骨样细胞的复合材料 近年来，随着骨缺损患者的增多，人们与骨组织工程的关系越来越密切，研究人员进一步将视线转移到BMSC强大的增殖分化能力上，通过体外诱导BMSC获得的成骨样细胞被应用于骨组织工程。李康杰[28]设计实验诱导形成成骨样细胞，诱导后的细胞种植到ACBM，两种材料的复合证明体外诱导的细胞与大鼠股骨ACBM具有一定的相容性，为进行体内实验打下基础。灭菌杀毒后的ACBM用PBS冲洗，浸入L-DMEM培养液中，然后置于含有CO2的培养箱中，一段时间后取出，在24孔板中分别培养24、48、72h。将分化来的细胞按照一定的浓度种植到ACBM，放入培养箱，获得供移植使用的骨修复材料。扫描电镜观察诱导分化的细胞分布匀称，长势良好，形态无显著差异。实验中将先前制备好的带有成骨样细胞的ACBM植入Welis大鼠股骨模型，微型接骨板固定，10mL氨苄西林冲洗骨缺损处。8周后对大鼠股骨缺损处采用荧光显微镜观察、HE和甲苯胺蓝染色等处理，结果显示实验组生成的新骨较对照组多，生成新骨速度快且长势良好，结果表明，添加了生物活性细胞的ACBM较单纯ACBM修复具备更强的促进骨形成的能力，ACBM和诱导成骨样细胞复合材料在骨修复领域中具有广阔的发展前景，同BMSC其他诱导分化细胞是否具有同样功能值得更深层次的探索。

3.2ACBM与兔胎儿成骨细胞的复合材料 一项研究将胎儿成骨细胞与成人原代成骨细胞和骨髓骨祖细胞的增殖能力进行了比较，发现胎儿成骨细胞以更高的速度增殖，碱性磷酸酶表达水平更高，是真正的成骨细胞祖细胞[29]，此外胎儿细胞还具有良好的免疫调节活性[30]。根据这一研究结论，Rashmi等[31]将牛股骨通过冷冻-解冻循环方法制备异种脱细胞骨移植基质，在妊娠21d健康新西兰白兔进行原代成骨细胞培养及脱细胞基质上细胞接种，剖宫产后，在全麻下用6mg/kg甲苯噻嗪肌肉注射，10min后用60mg/kg氯胺酮诱导胎仔，无菌1%PBS环境下采集兔胎儿。将胎儿颅骨和长骨切成小块，骨片经过处理后，第20天细胞开始从骨片中爬出，将细胞颗粒悬浮液浮在培养基中，并接种在每个支架上，放置在37℃由5%CO2组成的增湿大气中保存。扫描电镜观察脱细胞支架孔隙结构清晰，孔隙连通性良好，支架中成骨细胞在基质粘附均匀紧密，胶原纤维排列不规则，波浪交叉成网状。在低倍镜下，新鲜松质骨孔隙模糊，高倍镜下，能够观察到排列较整齐，紧密且扁平的胶原纤维。利用多种注射技术将成骨细胞主动接种到支架上后，可以在相差显微镜下观察到增殖旺盛的细胞活动。综上所述，脱细胞牛松质基质同兔胎儿成骨细胞复合，细胞活力和粘附作用不受影响，体外实验结果表明，脱细胞牛骨基质完全能够充当成骨细胞增殖和制备复合骨移植替代物的模板，利用细胞播种的多重注射技术可以成功且均匀地将细胞播种到支架上，这种细胞-生物材料组织结构为骨移植手术的未来方向提供了新的指引。

3.3ACBM与重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)的复合材料 rhBMP-2只有同载体缓释结合才能发挥成骨作用，并且不被吸收、降解或体液稀释[32]。孙新君等[33]利用人纤维蛋白原凝胶(FBG)复合具有骨诱导活性的rhBMP-2和ACBM材料，进一步构建rhBMP-2缓释载体并观察缓释效果。利用BMSC在体外可被显著扩增，产生碱性磷酸酶、骨钙素和I型胶原等物质的特性，研究人员设置不含rhBMP-2培养液的ACBM作为对照组，观察rhBMP-2/ACBM复合材料对体外培养的BMSCs增殖和分化的影响。并采用复合材料修补兔桡骨缺损部位，观察骨缺损部位的成骨效果。将ACBM浸入消毒的rhBMP-2，溶入FBG液中制备复合载体，ELISA试剂盒显示，添加rhBMP-2组AKP和骨钙素含量明显增高。术后4、8周X线摄片、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和组织学检测，结果显示复合rhBMP-2/ACBM材料组4周骨痂大量形成，8周骨缺损局部密度均增加，12周X线片可见新骨塑形。其中在术后4～8周可以观察到大量新生骨和软骨，骨缺损中心有多个骨化中心。由此可见，添加rhBMP-2复合材料具有良好的促进骨修复能力，增强细胞粘附后的延伸和活性表达。细胞培养显示，缓释载体释放的rhBMP-2虽然不能直接促进MSCs增殖分化，但可以间接作用于MSCs，增强其促成骨诱导及活性表达的能力，这些结论都为rhBMP-2/ACBM复合材料治疗骨缺损提供了应用基础。

4 多种材料联合ACBM形成的复合材料

4.1ACBM同可注射共聚物聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG，PECE)水凝胶复合 至今骨再生领域已经发现有几种可被降解的聚合物。其中，可注射水凝胶聚合物拥有易于给药、微创操作、患者方便和温和条件下即可形成三维(3D)网络的特性，使其在各个领域得到广泛的应用[34-36]。最重要的是热敏水凝胶可以在室温或更低的温度下自由注射，并可在原位形成凝胶库来修补组织中任意形状的缺损，因为其在体温环境下更易在受损组织形成空腔形状的特性，使得热敏水凝胶在骨再生领域的应用成为可能。

Ni等[37]以e-CL为原料，以Sn(Oct)2为催化剂，由聚乙二醇衍生物引发开环共聚等一系列操作获得聚乙二醇-聚己内酯二嵌段共聚物，进一步偶联获得研究所需的PECE共聚物[38-39]。PECE三嵌段共聚物溶解在二氯甲烷中，用石油醚从滤液中再沉淀两次以进一步纯化[39-40 ]，按照一定比例溶解在离子水中，得到纯PECE水凝胶[39]，最终将ACBM颗粒加入PECE水凝胶中成功制备拥有良好生物相容性的可注射热敏ACBM/PECE复合物材料。扫描电镜检查表明，ACBM/PECE复合材料中ACBM含量差异不会影响三维多孔结构，表明水凝胶复合材料有着良好的生物相容性。为了评估复合材料对骨再生的作用效果，实验中将ACBM/PECE水凝胶复合材料植入新西兰大白兔颅骨缺损处，设置PECE水凝胶填充另一侧缺损作为对照，其余操作处理均保持一致，连续观察两周发现实验组一般活动、能量、头发、粪便、行为模式等表现均优于对照组，利用数字X光机(德国西门子)、mCT80(瑞士巴塞尔斯多夫斯康科医疗股份公司)等仪器对实验组兔进行测量，颅骨修复速度和成骨情况均优于对照组，意味着ACBM/PECE水凝胶复合材料较单一材料具有更好的应用前景，有助于狭小部位骨缺损的注射型填充修复。

4.2ACBM-CS与碱性细胞生长因子的复合材料 研究表明，MSCs在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的作用下可以增强其增殖和成骨分化能力[41-43]；另一方面，bFGF还可以促进有丝分裂和血管再生，显著加快血管内皮细胞及成骨细胞等多种类型细胞的增殖及迁移。张志文等[3]进行bFGF复合ACBM-CS支架骨修复的实验研究中，观察比较负载与未负载bFGF的支架与未负载支架在治疗骨缺损中的应用效果。将ACBM-CS支架浸泡于含2mg/L bFGF的PBS溶液中[44],使溶液浸没支架获得生长因子复合支架。从微环境生长因子释放水平、细胞增殖、细胞粘附、成骨相关因子检测、影像学、组织学检查等多个方面对生长因子复合支架进行检测，结果显示，复合支架释放生长因子的总量稳定在一定水平，保证持续稳定发挥诱导成骨分化功能；扫描电镜下可观察到支架表面细胞粘附紧密，同时细胞的伪足深入材料内部，细胞长势良好；成骨相关的生长因子例如Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白及Runx2的mRNA表达明显高于单一未复合生长因子组；影像学检查可见生长因子支架组术后4周支架与宿主骨形成边缘融合，8周骨密度较高，二者融合良好，12周时骨缺损部位基本恢复；组织学染色可见生长因子支架组新骨成骨面积大于对照组，骨缺损区域成熟骨细胞明显增多，对照组结果稍差。研究表明，bFGF可以促进间质细胞、前成骨细胞、软骨细胞增殖分化，增强rhBMP、血管内皮生长因子等成骨因子表达释放，进而诱导新骨形成[45-46]。将实验组材料通过手术植入到兔股骨缺损模型中观察治疗效果，X线片显示：术后4周开始出现骨融合现象，成骨时间远远快于对照组，Lane-Sandhu X射线评分高于对照组。综上所述，复合ACBM-CS支架的碱性生长因子治疗骨缺损疾病，在具有良好机械性能的同时，还拥有较强的促进MSCs增殖作用，两者相互结合骨形成能力进一步增强，针对其他能够促进骨形成的因子值得更深层次的研究。

4.3ACBM-CS与脂肪组织基质血管基质性成分形成复合材料 脂肪组织基质血管性成分种类繁多，包括T细胞、外周血细胞及其他炎症细胞等，脂肪多数来源干细胞并具备以下特点：分化变成脂肪细胞并促进更新；分泌血管生长因子，促进内皮细胞修复血管损伤；不会随着细胞数量改变其增殖分化功能；含量丰富，提取便捷和免疫抑制特性[47-48]，以上几项特性奠定了脂肪组织基质成分应用于骨缺损修复的治疗基础。邵擎东等[49]根据脂肪组织血管基质成分的特性研究其在骨组织工程中的应用，提取制备原材料放置在适宜环境中保存，照射灭菌挑选生长良好的血管基质细胞按照一定的浓度置于经过处理的六孔板中，预湿培养液培养一段时间，最终得到血管基质成分/ACBM/CS支架复合物。一般检查发现实验组新西兰大兔活跃度显著高于对照组，其余无明显差别；X线片结果显示，实验组材料植入兔桡骨缺损模型2个月时呈明显灰白色；病理切片观察到骨小梁、少量长梭形细胞等骨形成细胞在中央管及周围旺盛生长。总之，实验组相较于未添加基质成分的对照组骨组织生长迅速，骨结构清楚，细胞数量显著增加。得出结论，添加基质成分的支架对兔桡骨的修复效果远远强于未添加基质成分组，脂肪组织基质成分在骨组织的修复治疗中具有较广阔的应用前景，值得进一步探索。

5 结语

本文主要概括了ACBM与有机材料、无机金属元素、组织细胞成分和多种材料联合形成具备不同特性复合材料在骨缺损修复的应用。ACBM骨修复材料在修复过程中会表现出各种不足，和ACBM相复合的天然生物衍生材料及人工合成生物高分子材料同样不能单独用于临床骨缺损修复，但是两类及以上材料复合可以扩展原材料的功能，应用于多种领域，本文归纳总结了所有同ACBM结合的天然或人工合成材料进行叙述。首先，通过一系列方法去除骨组织中的细胞、脂类等，留下重要的细胞外基质成分和细胞依附生长的骨结构，制备得到仍然具备良好的骨传导、骨诱导、生物相容性和适宜降解性的ACBM[50]。然后将ACBM与有机材料复合，增强间充质干细胞(MSCs)在ACBM表面黏附，促进复合材料的诱导成骨能力；与金属元素复合，Mg2+在骨形成中，有助于加快细胞增殖和成骨分化，抑制破骨细胞的活性[10-12]。Sr对骨的代谢具有双重作用，一方面促进骨祖细胞的增殖和分化，另一方面还能阻止破骨细胞的终末分化；与多种材料的复合都有不同程度促进MSCs的增殖的功能，同加入种子细胞作用基本一致，最终均可以加快成骨速度和增强诱导骨形成能力。

综上所述，与ACBM复合的材料本身都有不同程度的诱导成骨功能，采用特定方式复合不会影响ACBM结构和性质，还能进一步增强骨形成能力，将两种或多种材料在一定条件下构建成一种较为完美的复合材料用于多种类型骨缺损治疗。由此可见，可以将探索与ACBM相复合的材料为研究方向，两种或多种材料通过一定方式合成新型复合材料，从而实现治疗任何类型骨缺损的目的。

作者贡献声明：孙佳培：资料收集、论文撰写和文献检索；彭伟：审校、研究指导；西娜、谢聪钦：综述设计、论文修改