枯草芽孢杆菌在青贮饲料中的应用

韩雪林,张 磊,张 娟,李苏涛,阳伏林

(福建农林大学 动物科学学院(蜂学学院),福建 福州 350002)

青贮是厌氧条件下的自然发酵过程,主要是以饲料作物表面所附着的乳酸菌为主的有益菌利用饲料原料中的养分生长活动,产生乳酸等有机酸,降低青贮内环境pH,抑制有害菌群,从而得到高营养价值饲料,延长饲料作物保存时间。青贮饲料具有高价值、色香俱全、柔软可口、保存时间长的特性,是反刍动物日粮的主要能量来源。青贮过程中通常会加入抗生素、酸化剂、酶制剂等添加剂来保持或提升饲料的营养价值,为动物机体健康提供保障,规避饲料变质等问题。近年来,为响应国家“全面禁抗”的号召,抗生素及其产品在饲料行业中逐渐淘汰。益生菌绿色、健康且安全有效,全面禁抗后更是研究者们关注的焦点。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis, BS)是芽孢杆菌属的一种,耐高温且能分泌出抗菌物质,具有很强的抗菌能力和稳定性[1],其能消耗动物肠道内游离氧,促进有益厌氧菌的生长,抑制有害菌群,同时还能分泌多种消化酶,促进动物机体对营养物质消化、改善动物机体健康[2-3],其在替代抗生素上具有很大的潜力。BS作为新兴起的益生菌添加剂在畜禽养殖产业已作为绿色添加剂被广泛使用。但在青贮饲料方面对BS的研究较少, Phillip等[4]发现BS对体积庞大的作物的需氧稳定性有积极影响。表明BS在控制青贮饲料的需氧不稳定性方面可成为一种选择。Lara等[5]发现,接种枯草芽孢杆菌后玉米青贮的有氧稳定性提高,霉菌和酵母菌数量减少。青贮发酵过程中,BS能促进有益菌活动,抑制不良菌群的生长,提高青贮成功率及其品质、对营养物质的消化利用以及维持动物肠道健康和菌群平衡有促进作用[6],大大减少了不良因素对饲料青贮效果及饲料品质的影响。刘桂香等[7]在豆粕发酵饲料中发现BS能产生蛋白酶等多种水解酶类将原料中的纤维和蛋白等生物大分子水解,降低饲料原料中抗营养因子含量,提升饲料营养价值。孙林等[8]研究发现,经BS发酵处理后的豆粕其氨基酸与蛋白含量均在增加,同时不易被消化的物质也被分解。禾本科牧草纤维含量高、蛋白含量低且适口性差,极易影响饲料的利用率。BS分泌的纤维素等酶类对其具有很强的降解木质纤维素的能力。李立波等[9]发现BS提高了玉米秸秆的利用率,增加蛋白质含量。刘春雪等[10]添加BS的麸皮发酵处理后其纤维成分和抗营养因子含量得到降低,蛋白含量得到提高,同时发酵饲料中含有丰富的营养及菌群,有效促进动物健康生长、降低养殖成本。本文主要介绍了枯草芽孢杆菌的特性、作用特点,概述了其在青贮饲料中的应用,为枯草芽孢杆菌在畜牧养殖业的应用提供依据。

1 枯草芽孢杆菌

1.1 枯草芽孢杆菌的特性

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, BS)为好氧型革兰氏阳性菌,广泛存在于自然界,经常能在土壤中分离得到。BS有鞭毛、能运动,无荚膜,其菌落颜色多为白色或淡黄色,菌落形态凹凸不平。BS繁殖力强,营养水平要求低,能产生抗逆芽孢,在恶劣坏境中具有很强的抗逆性,能产生消化酶等多种酶类和代谢产物以分解有机物、参与机体代谢,是一种不含毒素且不产毒素的安全微生物[11-12]。

1.2 枯草芽孢杆菌在青贮中的作用特点

生产实践中,养殖者最关注的就是饲料的营养品质是否能促进畜禽的生长,BS可以产生纤维素酶等降低纤维含量的细菌素和酶,其可通过水解植物细胞壁增加可溶性糖的释放,改善青贮饲料的营养品质[13-14]。酵母是青贮饲料有氧降解的主要微生物,并降解饲料中的底物,产生二氧化碳和酸进而导致青贮饲料养分的损失[15]。 BS是芽孢杆菌属中重要生产者之一,其能产生抗真菌或抗细菌活性的代谢产物,对许多微生物表现出明显的拮抗作用,对细菌和真菌表现出很高的抗菌性[16],抑制有害菌微生物的生长,防止饲料的发霉变,提高有氧稳定性;乙酸是能够有效抑制有害微生物生长提高青贮料有氧稳定性的有机酸,BS可通过抑制酵母菌的生长和提高青贮有机物的消化率,提高青贮饲料中乙酸的含量和好氧稳定性[5]。厌氧是保证青贮成功的重要因素。BS发酵基础良好[17],且其是好氧型菌种,在青贮发酵过程中添加BS能够消耗青贮发酵容器中的氧气,快速达到一个厌氧环境,并能通过丙酮酸还原乳酸,为乳酸菌发酵提供有利条件[18-19],BS还能产生淀粉酶等将多糖分解成单糖,为乳酸菌的生长提供碳源[20],提高青贮成功率。同时,BS能产生抗生素类的细菌素、有机酸等提高青贮饲料的营养价值、降低青贮料中的抗营养因子和pH抑制有害菌的活动[21-22],提高青贮料的适口性。

2 枯草芽孢杆菌在青贮饲料中的应用

2.1 对青贮发酵的影响

作为饲料添加剂,益生菌添加剂在畜牧养殖业已得到了广泛的应用。添加剂的使用旨在有效的调控青贮的发酵进程和改善青贮料的发酵品质。BS作为新兴起的益生菌,得到了众多学者的关注。有报道称在青贮过程中接种BS不改变玉米青贮的化学特性和损失[23]。BS能够分泌多种酶及细菌素如阿魏酸酯酶和α-淀粉酶,在木质素和半纤维素酯键间起作用,破坏细胞壁的稳定结构,降低饲料中纤维含量,各种酶之间又能相互作用生成一定量的粗蛋白质,改善青贮饲料品质[24]。Lara等[5]在玉米青贮中单独添加BS和与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, LP)联合接种发现单独添加BS处理组中中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber, NDF)含量最低。朱佳文等[25-26]在桑叶发酵中加入BS及其与地衣芽孢杆菌复合菌后降低了粗纤维、NDF和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber, ADF)含量。BS具有较强的产蛋白质能力[26],在青贮中添加BS能提高饲料蛋白含量。黄光云等[27]研究表明在桑枝叶青贮中加入BS提高了粗蛋白质(Crude protein, CP)含量,纤维含量降低。Shi等[28]报道在玉米-豆粕固体发酵中添加BS对CP的提高有增强作用。有机酸含量和pH是青贮料发酵品质的评判指标,青贮料中高浓度乳酸和低浓度丁酸能快速降低pH,抑制菌群的活动[29],提高青贮料品质。BS能产生抗菌肽物质,加速同型发酵乳酸菌的活动,乳酸含量增加,改善青贮发酵,抑制不良细菌的生长,降低蛋白质水解[30]。朱佳文等[25]在桑青贮中添加BS,氨态氮/总氮的比值显著降低,青贮料中蛋白质的降解能力受到抑制,青贮发酵品质得到改善。BS还可以产生纤维素酶,作用于植物细胞壁,将其水解增加可溶性糖的释放,提高乳酸含量,进而改善青贮营养品质[14]。

2.2 对有氧稳定性的影响

好氧稳定性被定义为青贮饲料超过环境温度2 ℃所需的时间[31]。除此之外,pH的评估以及有害微生物的出现也被用作确定饲料稳定性的标准[23]。饲草保存时间主要与饲料抵抗好氧腐败菌和抗氧化的能力息息相关,青贮饲料在开封饲喂后暴露于空气中,氧气的进入会激活酵母菌和霉菌等好氧菌的活动,青贮饲料温度升高,乳酸降解,pH升高,有害菌群剧烈活动造成青贮料的腐败变质,有氧稳定性降低[32-33],饲料保存时间缩短[34]。发酵后,青贮料中所残留的可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates, WSC)浓度过高易引起不良微生物的生长,降低青贮饲料有氧稳定性[35]。为使青贮饲料保存良好通常添加不同菌剂迅速降低饲料酸碱度,抑制好氧菌的活性,防止饲料的好氧劣变[36]。BS抗氧性强能产生与其它细菌有拮抗活性的抗微生物蛋白细菌素及类似细菌素的代谢物,有抑制酵母菌和霉菌的生长繁殖,提高饲料有氧稳定性、抑制饲料有氧腐败的作用[37]。青贮料中pH过高,不良微生物活动未受到抑制,进行二次活动,造成青贮饲料进一步pH升高,促进不良微生物的生长[38]。青贮中添加BS有效降低了青贮酸碱度,抑制了有害菌的滋生[39]。酵母菌是影响青贮料有氧稳定性的主要有害微生物之一[40],它能降解乳酸,使饲料温度和pH升高,有害菌大量繁殖,导致青贮饲料的腐败[41-42]。Borrani等[43]证实酵母计数超过100.000 UFC/g饲料(5 log10UFC/g)导致玉米青贮饲料稳定性低。BS能产生抗真菌生长的化合物抑制酵母菌和真菌的生长,降低青贮饲料的变质程度,增强饲料有氧稳定性[44]。Lara等[5]在玉米青贮中进行单独添加BS及与LP复合添加处理后发现,青贮96 d后单独处理组酵母菌数量最低,有氧稳定性高。Basso等[23]也发现接种BS的玉米青贮的有氧稳定性有所改善。乙酸和丁酸是控制有害微生物的有机酸,其含量对饲料有氧稳定性有一定的影响,但丁酸过多表示青贮饲料梭菌污染严重[45-46]。Gandra等[47]在甘蔗青贮发现BS与布氏乳杆菌(Lactobacillus brucei, LB)联合处理比LB处理乙酸含量高,丁酸含量低,其有氧稳定性得到有效改善。

2.3 对青贮中微生物菌群的影响

青贮原料本身具有复杂的微生物菌群,包括有益菌群和有害菌群。青贮发酵过程实则是有益和有害微生物交替演变的过程,其变化影响饲料青贮品质[48]。微生物菌群与青贮样本自身[49]、添加剂种类[50]、青贮条件等多种因素有关。青贮中添加外源菌剂能调控发酵过程中的微生物区系[30],提高乳酸菌等可促进发酵优势菌群的丰富度,相对降低霉菌、腐败菌等有害菌群的丰度进而得到较好品质的青贮饲料,延长储存时间,提升青贮料营养价值。芽孢杆菌通过产生细菌素和抗菌物质等抑制有害微生物的生长,进而调控青贮饲料微生物的组成[51]。BS能产生抗真菌化合物及抗生素类物质,如以肽类等为主的抗生素,抑制有害微生物的生长,调节青贮饲料中的微生物菌群[52]。Basso等[53]在玉米青贮中接种不同浓度BS后发现,接种5×105cfu/g饲料浓度时可有效控制微生物的生长,得到较低的酵母数量,较高的丝状真菌数量。Bai等[39]研究发现接种BS,乳酸菌丰度增加且有效抑制了肠杆菌和沙门氏菌等不良菌群,降低了青贮饲料微生物多样性及丰富度。Lara等[5]在玉米青贮中添加BS后酵母菌和霉菌数量显著降低。Bonaldi等[53]研究表明在玉米青贮中添加9 log10cfu/kg饲料的BS时孢子形成菌数量增多,在青贮60 d时添加量为8 log10cfu/kg饲料时乳酸菌数量最多;所有的BS处理中酵母菌数量降低。Gandra等[54]在向日葵青贮研究中表明,BS可通过降低好氧菌和腐败菌的数量,增加乳酸菌的数量提高青贮微生物质量。

3 联合菌剂在青贮饲料中的应用

为取得更好的青贮效果,将不同以及不同类型的微生物菌剂混合能取长补短,互相弥补,提高青贮发酵品质及效率[55-57]。赵蕊蕊等[58]在青贮中添加BS复合菌剂能降低青贮料的NDF、AD、酸性洗涤木质素(Acid detergent lignin, ADL)含量以及CP损失,进而提高“张杂谷”的青贮品质。穆胜龙等[59]甘蔗尾的青贮研究中发现BS和LP的混合添加,青贮料营养品质及有氧稳定性得到很大的提升,尤其是添加比例为1∶2时效果最显著。青贮过程中,微生物的种类对青贮发酵的影响极大,多种菌剂混合添加更能丰富青贮料的菌群组成,促进青贮优势菌群的生长繁殖,加强优势菌群的主导作用,更加利于青贮发酵、提高青贮料品质。Bai等[39]研究发现,LB和BS的联合接种后青贮苜蓿中乳酸菌丰度得到增加,二者共同促进了乳酸菌的生长。在甘蔗尾青贮中将LP、BS和米曲霉联合接种后显著降低了青贮料的pH和NH3-N浓度,不良菌群的活动及蛋白质的降解受到抑制,提高了乳酸杆菌属丰度,同时降低了毕次酵母属丰度,保证了青贮饲料的发酵品质[60]。王凤林等[61]在玉米秸秆青贮中按1∶1比例添加BS和LP,青贮后玉米秸秆的pH、NDF、ADF和NH3-N含量降低,青贮品质优良,效果显著。官武太等[62]使用植物乳杆菌、戊糖片球菌和枯草芽孢杆菌发酵高梁后,DM和乳酸含量增加,乙酸、NDF和ADF含量降低。Ohyama等[63]报道称,有氧条件下,WSC高,则会提高青贮饲料的稳定性;反之,青贮饲料将会发霉变质。丙酸抗真菌能力强,对饲料有氧稳定性的提高有促进作用[64]。刘欢欢等[20]研究表明,在有氧暴露后添加植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌混合菌剂能有效抑制微生物对WSC的利用,保留更多的WSC含量,且其丙酸含量显著高于对照组及商业添加剂组,有效抑制不良菌群的生长活动,提高紫花苜蓿的有氧稳性。

4 小结与展望

BS作为新兴起的饲料益生菌添加剂,具有很大的代替抗生素的潜力。在青贮上的应用研究较少,特别是在改善青贮料营养价值机制、发酵过程中的代谢产物及作用特点值得我们深入探究。近年来,高通量测序等生物学信息技术的不断发展和完善为青贮中微生物菌群的研究提供了便利和技术支撑。今后,对益生菌添加剂在青贮上的研究应不断地向前推进:加强菌剂对青贮作用机制的研究,特别是复合剂的联合作用机制,规避风险,推动青贮技术发展,降低成本、提供安全保障;研究青贮菌剂在青贮过程中抑制高霉变反应、增强青贮饲料有氧稳定性的作用调控机制。