细胞自噬与糖尿病微血管并发症的关系研究进展

杨佳惠, 庄淼, 王杨宁致, 蔡季平, 王晓露, 姚勇

(南京医科大学附属无锡人民医院 1. 眼科; 2. 临床研究中心, 江苏 无锡 214023)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)及其并发症的患病率近年来持续快速增长,对全球健康的不利影响不可忽视。高血糖是发生糖尿病微血管并发症(diabetic microvascular complications,DMC)的主要危险因素[1]。DMC是糖尿病最常见、最重要的慢性特异性并发症,其典型病理特征是微循环障碍及微血管基底膜增厚。DMC多出现在微血管分布集中的部位,如视网膜、肾脏、神经周围等,引起糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)和糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)等疾病[2]。现代医学对DMC的确切发病机制尚未完全阐明,近年来研究发现,自噬功能紊乱和DMC之间有比较密切的关系,本文对该领域的研究进展进行综述。

1 自噬

自噬是一种消除细胞内受损细胞器和缺陷蛋白的溶酶体降解途径,对维持细胞稳态至关重要。自噬按照发生过程可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬(以下称为自噬)是最相关的途径,涉及具有多个囊泡融合事件的复杂的自我降解过程[3],包括下列重要步骤:① Beclin-1/囊泡分类蛋白34(vacuolar protein sorting 34,Vps34)在内质网和其他膜上响应应激信号通路控制囊泡的形成;② 自噬相关蛋白(autophagy-related protein,Atg)5、Atg12与Atg16L相互作用,囊泡多聚化;③ 微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)加工,自噬囊泡膜延伸,包裹待降解底物,形成自噬体;④ 自噬体与溶酶体融合,内容物被酶降解[4]。这中间任何一环节受损都会导致自噬功能障碍。

在缺氧、高糖、生长因子去除、营养物质缺乏或活性氧释放增强等各种应激条件下,自噬水平上调,以适应细胞对营养物质和能量增加的需求[5]。另一方面,在自噬过载时主要表现出对细胞、组织的损伤作用。因此,根据细胞微环境的变化、疾病进展的阶段和治疗干预措施等不同,自噬可能发挥其双重性效应,参与代谢、衰老、癌症等疾病的进展[6-8]。

2 自噬的调节

自噬受细胞中的重要信号途径调节,包括应激信号激酶通过磷酸化B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)促进Beclin-1与Vps34的相互作用,增加吞噬泡及自噬体形成,促进自噬[9]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是决定细胞自噬水平的中心信号分子,它是将代谢、生长因子和能量信号整合到自噬水平的关键部分,通过抑制unc-51样自噬激活激酶1(unc-51-like autophagy activating kinase 1,ULK1)复合物,在脂质双分子层形成自噬体的早期阶段介导其对自噬的影响。当饥饿、缺氧和细胞内低ATP水平时,5′-AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)被激活,降低Rheb(一种Ras样的小GTPase)活性从而抑制mTOR活性,激活自噬;或者AMPK直接磷酸化激活ULK1复合物,继而激活下游类磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphati-dylinositol-3-kinase,PI3K)复合体,募集多种自噬相关物质。相反,当营养丰富或给予一些生长因子信号可以通过胰岛素受体及其他生长因子受体来激活PI3K和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT),增加Rheb GTPase活性从而促进mTOR活性,自噬被抑制[10-11]。

3 自噬与糖尿病

胰岛β细胞专门用于分泌胰岛素以响应血糖浓度的变化,已经证明自噬参与了受胰岛素水平影响而自我调节的胰岛β细胞以及肝脏和骨骼肌的病理生理学功能。在高糖环境下,胰岛β细胞容易受到内质网应激影响,而自噬已被证明对内质网应激具有保护作用并促进线粒体更新,进而使机体适应高糖环境[12]。但当自噬功能障碍时,如Atg7基因缺陷小鼠表现出胰岛β细胞退化、胰岛素分泌减少和糖耐量受损[13]。在一项关于离体的人类胰腺的研究中,接触棕榈酸酯(一种代谢内质网应激源)可导致胰岛β细胞凋亡增加和胰岛素分泌减少,自噬诱导剂雷帕霉素治疗可抵消,而在给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)或刀豆素-A处理后加剧[14]。因此,自噬通量的异常可能导致糖尿病进展。

4 自噬对DMC的影响

4.1 自噬与DR

DR是糖尿病最常见和最严重的眼部并发症,是导致工作年龄人群(20～74岁)可预防性失明的主要原因[15]。DR的主要特征是先出现微血管壁周细胞丢失,随后发生微血管瘤、血-视网膜屏障破坏、血管渗漏,进而无细胞毛细血管、新生血管形成,最终可引起玻璃体出血和牵拉性视网膜脱离,甚至失明[16]。目前认为DR的发病机制是长期高血糖导致多种生化途径的异常调节,如氧化应激和自由基形成、晚期糖基化终产物的产生和自噬功能障碍等[5]。而DR时,自噬水平降低,受损或老化的细胞器和缺陷蛋白质等成分积累,进一步加剧了视网膜的神经和血管变性。

Wang等[17]的研究表明,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠视网膜中Beclin-1、Atg7和LC3-Ⅱ的表达较对照组减少;而用乙酰肝素酶抑制剂后,通过抑制mTOR通路而促进自噬,可以抑制炎症因子的分泌,减缓DR的进展。在高糖处理的大鼠视网膜Müller细胞中,黄连素通过激活AMPK信号通路增强自噬,从而减少高糖诱导的Müller细胞凋亡[18]。而用3-MA抑制自噬可显著增加DR时视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的凋亡[19]。Shi等[20]研究发现,人视网膜色素上皮细胞株(retinal pigment epithelial cells,ARPE-19)暴露于高糖环境中,自噬体数量增加、LC3-Ⅱ蛋白表达上调。而通过3-MA预处理抑制自噬作用,则促进核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体的形成及炎症因子的分泌,促进ARPE-19细胞的凋亡。Mao等[21]研究发现,线粒体去乙酰化酶Sirtuin 3(SIRT3)可以促进自噬,进而下调血管内皮生长因子和缺氧诱导因子1α的表达来抑制胰岛素诱导的视网膜新生血管形成。

另有研究表明,长期高血糖会导致mTOR抑制,从而导致自噬失调。而用mTOR激活剂MHY1485阻断自噬后,可以显著挽救RGC凋亡[22]。同样地,Wang等[23]发现一种编码组蛋白H1.2蛋白的基因(HIST1H1C)敲除后显著降低了基础和高糖诱导的自噬,减轻了炎症和细胞毒性。相反,HIST1H1C过表达导致自噬增加、神经胶质激活和神经元丢失,这是DR早期发现的病理变化。这些发现表明,自噬的过度刺激与视网膜细胞死亡增加有关,并参与了DR的进展。Fu等[24]研究了自噬在DR中的这种双重调节作用,结果表明较低浓度(50 mg/L)的高氧化糖化低密度脂蛋白(HOG-LDL)促进自噬介导的人视网膜毛细血管周细胞存活,而较高浓度(200 mg/L)即严重压力导致自噬介导的细胞死亡,随着刺激水平的变化,自噬发挥着不同的作用。

糖尿病模型中自噬的调节作用随着疾病的进展而有所不同,结果取决于所分析的时间点。有研究[25]观察到在STZ诱导的糖尿病大鼠中,视网膜LC3-Ⅱ表达的双相性,其特征是与对照大鼠相比,LC3B在2个月大的糖尿病大鼠视网膜中增加,而在4个月大的糖尿病大鼠视网膜中显著减少。该实验中初始自噬水平的上调可能是对高血糖刺激适应性调节的一部分。随着糖尿病病程的延长,调节系统过载,自噬明显减少,导致视网膜细胞的凋亡。

4.2 自噬与DN

DN在全球仍是导致终末期肾衰竭的主要原因。其特征包括肾小球基底膜增厚,足细胞受损,并伴有肾小管萎缩及蛋白尿。足细胞是构成肾小球滤过屏障的重要部分,在维持肾功能方面高度专业化,是DN发展过程中至关重要的肾细胞。由于足细胞不能进行适当的有丝分裂过程,缺乏增殖能力,依靠自噬维持细胞内环境的稳定,因此具有较高的基础自噬活性[26],而这种高水平的自噬不仅是肾脏在高糖下的一种保护机制,也是维持足细胞正常的结构和功能所必需的,异常自噬被认为是DN进展为终末期肾病的重要催化剂[27]。大量的证据表明,mTOR是影响DN发展的最主要自噬负调节因子,Xiao等[28]也证明在糖尿病小鼠中,雷帕霉素通过抑制mTOR,增加足细胞LC3的表达和自噬水平,减少白蛋白排泄、足细胞足突融合、肾小球基底膜增厚和基质堆积。肾小管间质损害是DN进展的重要标志,近端肾小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cell,PTEC)构成肾小管间质的主要部分,是血糖水平升高的重要靶点。在基础条件下,与足细胞相比,PTEC在小鼠中的自噬水平通常较低[29]。然而,PTEC的主动转运会消耗大量能量,使其更容易受到缺氧或能量剥夺。因此,维持正常的自噬水平可确保PTEC细胞在上述恶劣环境中的存活。与mTOR在足细胞中的作用类似的是,Kitada等[30]观察到给予Wistar肥胖大鼠极低蛋白饮食可以抑制mTORC1通路,激活自噬,减轻肾脏炎症,改善PTEC的线粒体形态和足细胞改变以及与之相关的细胞凋亡,减缓晚期DN的进展。因此,大量蛋白尿的糖尿病患者足细胞和PTEC自噬不足,自噬受损又进一步加剧了DN进展,而恢复自噬过程可以减缓DN的进展[31-32]。

当然,自噬的正向调节因子如SIRT1和AMPK也能影响DN的发病机制。在DN中SIRT1的表达降低[33],天然多酚白藜芦醇以及褪黑激素可通过激活SIRT1或AMPK-mTOR信号通路激活自噬,在DN中具有肾脏保护作用[34-35]。二甲双胍也被证明对DN具有潜在的保护作用,Xu等[36]在糖尿病大鼠模型中发现二甲双胍可通过激活AMPK和SIRT1并抑制转录因子叉头盒O1来减轻氧化应激并增强自噬,从而缓解DN的发展过程。此外,用于治疗2型糖尿病的新型药物钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(如达格列净、恩格列净)也可激活SIRT1/AMPK,从而抑制AKT/mTOR信号传导并调节自噬[37]。胰高血糖素样肽-1受体激动剂(如利拉鲁肽、索马鲁肽)通过影响AMPK-mTOR信号通路正向调节自噬通量[38]。这两类药物还可通过降糖、利钠、增加肾小球滤过率等方式,诱导多种有益的血流动力学和代谢变化,这有助于减少氧化应激和炎症,促进肾组织中自噬平衡的恢复,延缓DN的进展[31]。

4.3 自噬与DPN

糖尿病性神经病变是一组临床上多样化的疾病,可以影响周围神经系统和自主神经系统。DPN是糖尿病神经病变中最常见的形式,导致近30%的2型糖尿病患者出现疼痛、生活质量下降、步态障碍和抑郁症状[39]。DPN患者的早期变化包括细胞外基质蛋白的积累、炎症、神经缺血、周围神经轴突变性和节段性脱髓鞘,这会导致感觉运动传导延迟和不可逆的神经损伤,继而导致DPN的进行性发展[40]。施万细胞是周围神经系统中的神经胶质细胞,通过包裹无髓轴突以及分泌神经营养因子维持周围神经结构和功能的完整性,并修复受损神经[41]。多项研究观察到自噬在周围神经病理过程中的激活迹象,在轴突再生期间,自噬体广泛出现在再生轴突和Bungner带(受损神经远端部位的再生轨道)中相关施万细胞的胞质中[42]。

基于自噬在神经病变中的重要作用,很多研究围绕调节自噬水平对DPN的作用。一方面,研究者观察到自噬在神经损伤后的髓鞘施万细胞中激活,当神经生长因子刺激神经损伤模型后,进一步激活施万细胞中的自噬,增强髓鞘碎片清除并加速神经再生[43]。另一方面,在脱髓鞘施万细胞和培养的神经节段中,通过抑制自噬,如条件性敲除Atg7或者给予自噬抑制剂3-MA和巴弗洛霉素A1,可抑制受损神经中的髓鞘蛋白和脂质分解,即抑制了受损神经的修复[44]。Chung等[45]发现,西那卡塞(临床上治疗继发性甲状旁腺功能亢进的拟钙剂)可以通过诱导AMPK活化,促进自噬和改善细胞凋亡,显著缓解人类施万细胞和坐骨神经中DPN相关症状。

然而,也有研究者发现[46],在STZ诱导的DPN大鼠模型中Lipin1(一种磷脂酸磷酸酶,参与维持正常的周围神经传导功能)表达下调,同时可见自噬过度活跃,可能增加施万细胞凋亡并导致DPN大鼠坐骨神经脱髓鞘的作用;Lipin1过表达则显著抑制了高血糖诱导的自噬过度活跃和细胞凋亡,改善坐骨神经的病理变化,增加运动神经传导速度,减轻DPN。此外,Wang等[47]发现高糖刺激可以通过激活JNK通路引起大鼠施万细胞过度自噬,触发细胞凋亡;用丹酚酸B(从丹参中提取的新一代天然生物活性物质)处理后,自噬下调,使细胞免于凋亡。这种自噬作用对比鲜明的结果需要进一步研究。

5 总结与展望

细胞自噬在糖尿病及其微血管并发症中发挥重要作用,然而,它的确切作用仍然难以捉摸,是发挥抵消还是促进糖尿病及微血管并发症还不明确。在轻度压力下或在疾病的初始阶段,自噬是一种具有促生存和抗凋亡作用的适应性反应[48];另一方面,在严重压力和疾病后期,由于长期损伤导致系统过载,自噬失调导致细胞凋亡加剧[24]。自噬作为干预糖尿病及其微血管并发症的新靶点有巨大潜力,需要进一步地研究自噬在DMC中的具体参与机制,为DMC临床诊治提供理论依据。