补阳还五汤对线栓大鼠模型脑损伤和血脑屏障通透性的影响

郑文旭，张保朝，李富慧，方 立

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是临床常见脑血管疾病，致残率、病死率极高，临床调查显示，我国70%左右脑血管疾病病人属于缺血性脑卒中，缺血性脑卒中的预防和治疗形势十分严峻[1]。研究显示，急性缺血性脑卒中后瀑布效应引起的血脑屏障通透性增加及随之继发的脑水肿是导致疾病高致残率和病死率的主要原因[2-3]。因此，缺血性脑卒中抢救过程中，除及时溶栓治疗外，减轻血脑屏障通透性破坏对减轻缺血性脑卒中继发性脑损伤十分重要。近年来，中医药因低毒、来源广泛、效果明显等优势在临床中已广泛用于心脑血管等疾病的防治。缺血性脑卒中属中医“中风”范畴，本病多为本虚标实，以气血逆乱、气化停滞、气虚血瘀为基本病机，故治疗应以益气活血为要[4]。补阳还五汤是由清代王清任创立的益气活血经典名方，具有抗氧自由基毒性、增加心脑血管血流量、改善微循环等作用，临床已广泛用于脑卒中后遗症的治疗，疗效确切[5]。本课题组前期临床研究显示，补阳还五汤治疗缺血性脑卒中病人，可有效改善病人临床症状和体征，疗效确切，但其具体作用机制尚不明确[6]。为此，本研究采用线栓法复制大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，通过补阳还五汤干预，评估补阳还五汤对MCAO脑损伤及血脑屏障通透性的影响，并进一步探讨其调控机制，为临床应用补阳还五汤治疗缺血性脑卒中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠，75只，4周龄，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号SCXK(京)2019-0008，使用许可证号SYXK(京)2019-0022。动物实验操作符合减少、替代、优化3R原则。

1.1.2 药物制备 补阳还五汤煎剂：黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍5 g，川芎3 g，桃仁3 g，红花3 g，地龙3 g，加水浸泡4 h，水煎2次，煎液浓缩至生药含量为2 g/mL，pH 7.0。中药药材由河南中医学院第一附属医院提供。

1.1.3 主要试剂和仪器 注射用血塞通冻干粉(黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，国药准字Z20026437，400 mg)，神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(美国Mybiosource公司)，伊文思蓝[EVans Blue，EB，阿拉丁试剂(上海)有限公司]，兔抗大鼠Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、水通道蛋白-4(AQP-4)、紧密连接相关蛋白(Claudin-5)多抗(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(中杉金桥生物技术有限公司)。DYY-12D型电泳仪、水平电泳槽(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及干预 75只SD大鼠随机分为假手术组、MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组，每组15只，除假手术组未进行栓塞外，余各组采用线栓法建立MCAO大鼠模型。取建模成功大鼠，MCAO组13只，补阳还五汤组13只，血塞通组14只，联合组14只，均于术后2 h进行干预。补阳还五汤组按5 mL/kg体质量灌胃补阳还五汤煎液(含生药2 g/mL)，每日1次，连续7 d；血塞通组尾静脉注射10 mg/kg体质量的血塞通注射液，每日1次，连续7 d；联合组灌胃补阳还五汤煎液后2 h尾静脉注射血塞通，给药剂量及给药方式同前。

1.2.2 MCAO模型制备 采用线栓法建立MCAO模型[7]：戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，颈部剃毛备皮，颈部正中切口，钝性分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，从左侧颈总动脉近心端及颈外动脉分叉处用手术线结扎，然后在颈总动脉分叉处开一小口，将灼烧光滑的一端从切口处缓慢向入颅方向推进，推进18～20 cm遇阻力时停止(假手术组仅推进1 cm)，手术线结扎固定尼龙线，清理术区，缝合伤口并消毒。大鼠清醒后，采用Longa法评估各组神经功能，无神经系统异常表现计0分；不能完全伸展右侧前爪计1分；行走时旋转计2分；行走倾倒计3分；无自发活动或意识昏迷计4分；以评分1～4分为建模成功，剔除术中或术后24 h内死亡大鼠。

1.2.3 大鼠行为学评估 给药1 d、3 d、7 d采用Longa法评估各组神经功能，评估方法同前述；采用贴纸去除实验评估大鼠感觉功能[8]：将大鼠放置于50 cm×50 cm方形箱子中，适应5 min后，将贴纸贴在双侧前肢远端放射状区域，放回箱子，摄像头记录双侧贴纸所需时间，若120 s内未去除贴纸则计120 s，每只大鼠测试5次，每次间隔5 min，取平均值。

1.2.4 血清中枢神经特异性蛋白(S-100β)、NSE水平检测 给药1 d、3 d、7 d，大鼠尾静脉采血2 mL，室温静置分层后，3 500 r/min离心8 min，离心半径10 cm，取血清采用酶联免疫吸附法检测待测血清样本，按照试剂盒说明书步骤操作，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，依据标准曲线计算待测血清中S-100β、NSE含量。

1.2.5 血脑屏障通透性检测 给药7 d末次采血完毕后，每组随机取7只大鼠，采用EB染色检测各组血脑屏障通透性。按照4 mL/kg尾静脉注射质量分数2% EB溶液，2 h后，腹腔麻醉大鼠，剖开胸腔暴露心脏，剪开右心耳，从左心室灌注生理盐水，至灌注液无色透明。冰上断头取脑，矢状缝切开左右脑，称重后加入1 mL/100 mg脑组织的甲酰胺溶液，37 ℃恒温箱孵育48 h，匀浆后，12 000 r/min离心20 min(离心半径12 cm)，取上清液于620 nm波长处检测光密度值，根据EB标准品绘制标准曲线，计算EB含量(μg/mL)。

1.2.6 脑组织中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表达量检测 给药7 d末采血完毕后，每组随机取6只大鼠，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测脑组织各基因表达情况。脱臼处死大鼠，冰上分离脑组织，取缺血侧脑组织，Trizol法提取总RNA，测定RNA浓度，逆转录获得cDNA并以之为模板进行扩增，按照试剂盒说明配置反应体系，反应条件：94 ℃预变性5 min；40个重复(94 ℃变性30 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s)；72 ℃再延伸5 min。2-△△CT法计算目的基因Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5的相对表达强度。Wnt3a、β-catenin以β-actin为内参对照，AQP-4、Claudin-5以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参对照。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.7 脑组织中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表达量检测 采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测脑组织中各蛋白表达情况。取缺血侧脑组织，液氮中研磨并转至离心管，加入细胞裂解液冰上裂解25 min，4 ℃预冷离心机12 000 r/min离心15 min(离心半径12 cm)，取上清液进行蛋白定量；取50 μg待测样本与等体积上样缓冲液混匀后，沸水浴8 min，12 000 r/min离心15 min(离心半径12 cm)，取上清液进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转仪转至硝酸纤维素膜上，加入封闭液室温封闭2 h，加入稀释一抗[Wnt3a、β-catenin(1∶300)，AQP-4、Claudin-5(1∶500)]，4 ℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次×10 min后，加入二抗稀释液(1∶5 000)，常温孵育2 h，于暗室中曝光显影。扫描胶片后采用Image J图像分析软件分析各条带灰度值，Wnt3a、β-catenin与内参β-actin灰度值比值及AQP-4、Claudin-5与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察 75只大鼠参加实验，假手术组15只大鼠全部存活，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组分别剔除建模失败或死亡大鼠2只、2只、1只、1只，其余大鼠参与后续实验。假手术组术后苏醒精神状态逐渐转好，术后1 d精神状态逐渐恢复；MCAO组出现喜卧、精神萎靡、局部毛发脱落、对外界刺激不敏感、行为能力下降等现象，随着观察时间延长无明显改善；补阳还五汤组、血塞通组及联合组给药期间精神状态有所恢复，行为能力及反应能力有所恢复，随给药时间延长逐渐好转，且联合组好转最为明显。

2.2 大鼠行为学评估 与假手术组比较，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组给药1 d、3 d、7 d神经功能评分及贴纸去除时间均升高(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组给药3 d、7 d神经功能评分及贴纸去除时间均降低(P<0.05)；与补阳还五汤组和血塞通组比较，联合组给药3 d、7 d神经功能评分及贴纸去除时间均降低(P<0.05)，补阳还五汤组与血塞通组给药1 d、3 d、7 d比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。随着给药时间的延长，MCAO组神经功能评分及贴纸去除时间无明显变化(P>0.05)，联合组逐渐降低(P<0.05)；补阳还五汤组和血塞通组给药7 d神经功能评分及贴纸去除时间明显低于给药1 d和给药3 d(P<0.05)，给药1 d与给药3 d无明显变化(P>0.05)。详见表2、表3。

表2 各组大鼠神经功能评分比较(±s) 单位：分

表3 各组大鼠贴纸去除时间比较(±s) 单位：s

2.3 各组大鼠血清脑损伤标志物水平比较 与假手术组比较，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组血清S-100β、NSE水平均升高(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组血清S-100β、NSE水平均降低(P<0.05)；联合组血清S-100β、NSE水平低于补阳还五汤组、血塞通组，血塞通组S-100β、NSE水平低于补阳还五汤组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠血清脑损伤标志物水平比较(±s) 单位：μg/L

2.4 各组大鼠血脑屏障通透性比较 假手术组、MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织中EB含量分别为(1.25±0.20)μg/mL、(9.12±1.13)μg/mL、(7.68±1.04)μg/mL、(7.05±1.06)μg/mL、(6.11±1.12)μg/mL，组间比较差异有统计学意义(F=134.467，P<0.001，n=7)。与假手术组比较，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组EB含量均升高(t值分别为25.270，22.179，19.759，15.779，P均<0.001)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组EB含量均降低(t值分别为3.381，4.912，6.948，P均<0.01)；与补阳还五汤组和血塞通组比较，联合组EB含量均降低(t值分别为3.766，2.281，P均<0.05)，补阳还五汤组和血塞通组比较，差异无统计学意义(t=1.557，P>0.05)。

2.5 各组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA表达量比较 与假手术组比较，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织Wnt3a、β-catenin、AQP-4 mRNA相对表达量均升高，Claudin-5 mRNA相对表达量均降低(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织Wnt3a、β-catenin、Claudin-5 mRNA相对表达量升高，且联合组高于补阳还五汤组和血塞通组(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织AQP-4 mRNA相对表达量均降低，且联合组低于补阳还五汤组和血塞通组(P<0.05)。补阳还五汤组和血塞通组Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5 mRNA相对表达量比较(±s)

2.6 各组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白表达量比较 与假手术组比较，MCAO组、补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相对表达量升高，AQP-4蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织Wnt3a、β-catenin、Claudin-5蛋白相对表达量升高，且联合组高于补阳还五汤组和血塞通组(P<0.05)；与MCAO组比较，补阳还五汤组、血塞通组及联合组脑组织AQP-4蛋白相对表达量降低，且联合组低于补阳还五汤组和血塞通组(P<0.05)。补阳还五汤组和血塞通组Wnt3a、β-catenin、AQP-4、Claudin-5蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见图1。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与MCAO组比较，# P<0.05；与补阳还五汤组比较，△ P<0.05；与血塞通组比较，▲ P<0.05。

3 讨 论

随着我国老龄化加剧，缺血性脑卒中发病率逐年升高，已成为危害人们生命安全的主要疾病之一。缺血性脑卒中发病原因多种多样，包括高龄、高血压、高脂血症等均是导致其发病的高危因素[9-10]。缺血性脑卒中发病机制十分复杂，多种因素导致颈动脉粥样硬化斑块形成，易损性斑块进入大脑中动脉后导致脑组织血流供应不足，进而引起缺血缺氧性脑损伤[11-12]。血脑屏障的完整性是保持脑内环境稳定、维持中枢神经系统正常运行的基本结构，脑缺血后，血脑屏障主要结构毛细血管内皮及细胞间紧密连接、神经胶质膜等结构破坏，钠泵功能障碍，血脑屏障通透性急速增加，引起体液外漏，继发形成脑水肿[13-15]。因此，减轻血脑屏障通透性破坏对保护脑组织、促进神经功能改善有重要临床意义。

本研究应用补阳还五汤干预MCAO大鼠后，其神经功能评分降低，贴纸去除时间缩短，EB含量、血清S-100β、NSE水平均降低，且神经功能评分、贴纸去除时间及血清S-100β、NSE水平与西药血塞通比较差异无统计学意义，两者联合干预后改善更为明显，说明补阳还五汤可有效减轻缺血性脑卒中大鼠脑损伤，降低血脑屏障通透性。现代中医学认为，脑卒中后气血逆乱，气虚血滞，致脑络瘀阻，气化停滞，脉中津液不能正常运化，水瘀互结而脑窍闭塞，水溢于脑[16]。王清任认为，本病本虚标实，气虚为本，血瘀为标，因虚致瘀是其致病机制，治疗本病以补气为主，活血通络为主要原则，与现代中医学治疗缺血性脑卒中思路一致[17]。补阳还五汤以黄芪为君药，大补元气，使气血旺以治本；以当归尾为臣药，活血祛瘀，使脉络通以治标；另以赤芍、川芎、桃红、红花为佐药，强化活血祛瘀功效，地龙为佐药，通经活络，使周身脉络通畅，强化药力[18]。补阳还五汤重补气辅活血，标本兼顾，诸症向愈。张文敏等[19]研究表明，补阳还五汤辅助治疗急性脑梗死病人效果显著，可有效改善病人神经功能，提高生活质量，安全可靠，说明补阳还五汤辅助治疗急性期缺血性脑卒中效果确切。此外，陈旭宁等[20]应用超微补阳还五汤可有效改善恢复期缺血性脑卒中病人神经功能及生活质量，且抑郁症状得到缓解。林巧等[21]研究发现补阳还五汤可辅助治疗Ⅱ型精神分裂症，升高血清脑源性神经营养因子，说明补阳还五汤可促进脑神经功能恢复。本研究依据补阳还五汤组方各味中药功能及配伍特点，重补气促进脑络运化，辅以活血祛瘀促进脑窍通畅，血利则水通，使血脑屏障作用得以恢复。

此外，本研究显示，补阳还五汤组大鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin及紧密连接蛋白Claudin-5表达增加，而脑组织水通道蛋白AQP-4表达降低，且上述指标表达与血塞通差异无统计学意义，两者联合干预后Wnt3a、β-catenin、Claudin-5增加及AQP-4降低更为明显，说明补阳还五汤可能通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路、上调Claudin-5、下调AQP-4表达发挥调控作用。Wnt/β-catenin信号通路是中枢神经系统发育及神经元细胞增殖、分化的重要调控通路。已有研究证实，脑血管内皮细胞中Wnt/β-catenin信号通路异常对血脑屏障功能及脑血管发育有重要影响，但对其他部位血管发育及功能无明显影响[22-23]。Wnt3a是Wnt信号通路主要配体，通过与细胞膜特异性受体结合后，将信号传至β-catenin，β-catenin进入细胞核后启动下游靶基因转录、翻译等过程[24]。缺血缺氧脑损伤后激活Wnt信号通路，参与缺血缺氧条件的血管新生，修复受损脑组织，从而改善血脑屏障结构和功能[25]。Laksitorini等[26]研究显示，Wnt/β-catenin信号通路活性增强有助于维持血脑屏障通透性，与本研究结果相符。本研究应用补阳还五汤干预后，Wnt/β-catenin信号通路激活，信号通路相关蛋白表达上调，且紧密连接蛋白Claudin-5上调及水通道蛋白AQP-4下调，均有助于脑组织损伤的修复，说明补阳还五汤可通过Wnt/β-catenin信号通路促进缺血性脑卒中脑组织修复，进一步提示该信号通路可能是补阳还五汤的靶点通路，可为临床靶向治疗提供新的思路。

综上所述，补阳还五汤可有效减轻缺血性脑卒中大鼠脑损伤，推测可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，上调紧密连接蛋白Claudin-5、下调水通道蛋白AQP-4表达，减轻血脑屏障的破坏，达到保护脑组织的作用。本研究新颖之处在于采用动物试验探讨补阳还五汤减轻缺血性脑卒中大鼠脑损伤的可能机制，可为临床应用补阳还五汤治疗缺血性脑卒中提供理论基础。由于研究时间及经费有限，补阳还五汤是否通过其他信号通路减轻缺血性脑卒中大鼠脑损伤，仍需要进一步研究证实。在进一步的研究中应开展多通路研究，以证实补阳还五汤多靶点作用的特点，为其应用于临床治疗缺血性脑卒中提供更为坚实的基础。