无创产前筛查扩展性检测临床研究进展*

徐玉婵 综述，严提珍 审校

(柳州市妇幼保健院医学遗传科/柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室/柳州市生殖与遗传研究所，广西 柳州 545001)

中国出生缺陷发生率为5.6%，年均新增出生缺陷患者高达90万例[1]。染色体异常是导致新生儿出生缺陷最常见的遗传疾病，在新生儿中的发生率约为1/160。13、18、21-三体综合征是最主要的常染色体非整倍体疾病，特别是21-三体综合征在新生儿中的发生率较高，每800名活产婴儿中就有1例患有唐氏综合征(DS)[2]。目前，广泛开展的唐氏筛查准确性低、假阳性率高[3]，因而对高风险孕妇仍需进行有创性产前诊断，如抽吸绒毛、羊水、脐血等对染色体核型进行分析，进而增加了胎儿额外的流产风险[4]。香港中文大学卢煜明博士等于1997年首次报道了利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得母体外周血中Y染色体的特异DNA序列，进而证实孕妇外周血的血浆中具有胎儿游离DNA(cffDNA)，为无创产前筛查(NIPT)提供了科学基础[5]。2011年以来对新生儿非整倍体异常的NIPT得到一系列的临床研究证实，并被广泛用于临床[6-7]。现将NIPT在性染色体非整倍体(SCA)，双胎妊娠，染色体微缺失、微重复，单基因遗传病等临床检测中的研究进展综述如下。

1 NIPT的扩展性检测

1.1SCA SCA总发生率为1/500[8]，最常见者包括特纳综合征(45，X)、超雌综合征(47，XXX)、Klinefelter综合征(47，XXY)、超雄综合征(47，XYY) 和SCAs嵌合体。SCA的临床表型差异较大，患者大多数表现为性器官发育不良、性腺功能下降、不育或不孕等，但在智能与运动功能方面尚可。传统血清学产前筛查主要针对21、18-三体综合征和神经管缺陷的检测，并没有针对包括特纳综合征、克氏综合征等在内的性染色体异常的风险评估。有学者认为，在有DS筛查的国家SCA检出率低于50%，用于检测DS的方法不能扩展到检测SCA[9]。超声检查发现，颈部水囊状淋巴管瘤及胎儿颈后皮下透明层增厚与45，XO有关[10]，但目前对其他SCA的产前筛查没有特异度较高的方法。许多研究表明，NIPT可能是一种潜在的SCA筛查方法，但该技术尚有待于进一步研究。ZHANG等[11]对10 275例参加NIPT的孕妇进行分析表明，对NIPT所监测孕妇的染色体变异的总体阳性预测值(PPV)为54.55%(18/33)，检测特纳综合征(45，X)的总体PPV为29.41%(5/17)。说明NIPT可通过大规模并行基因组测序分析cffDNA鉴定胎儿性染色体异常，但对特纳综合征(45，X)的准确性尚有待于提高。美国一项大型临床试验研究表明，在69 794例单胎妊娠孕妇中检出1 359例(1.95%)NIPT高风险结果，其中 SCA的PPV为69.0%[12]。BEVILACQUA等[13]评估有关筛查SCA患者选择和影响该选择的因素发现，3 162名孕妇中61.9%选择了SCA筛查。118例(73.3%)筛查高风险的随访数据表明涉及X染色体的SCA的PPV低于涉及Y染色体的SCA。其中5例47，XYY病例均被正确识别，PPV为100%;47，XXY病例PPV为63.33%(19/30);47，XXX和45，X的PPV分别为22.73%(5/22)和24.59%(15/61)。在中国湖南22 2107名孕妇参与的一项大规模研究结果也显示，NIPT筛查X单体的真实阳性率较低，而其他SCA的预测相对准确[14]。X染色体变异的孕妇也可能会影响cffDNA产前检测结果，从而产生假阳性或假阴性。常家祯等[15]在发现的SCA高危病例中与侵入性产前诊断结果并不相符的74例患者中有19例母体基因拷贝数变异(CNV-seq)检测出现母体X染色体变异，占SCA假阳性病例的25.68%(19/74)。另一项研究结果显示，母体因素是NIPT性染色体异常高假阳性的主要因素，使用 cffDNA(ChrX)/cffDNA比例可暂时区分异常游离DNA的母源或胎儿来源[16]。当比率大于2时所有胎儿的核型均正常，而75.00%(6/8)的母亲X染色体异常;比率小于或等于2时只有10.00%(4/40)的母亲有X染色体CNV改变，而32.50%(13/40)的胎儿有性染色体CNV异常。值得强调的是，当产前诊断结果与NIPT结果不一致时建议检测母体外周血CNV-seq找出假阳性或阴性结果的原因，并且不建议对已知X染色体变异的孕妇进行NIPT。

1.2双胎妊娠 自然双胎发病率大约为1/90，但由于国家“二孩”，甚至“三孩”政策的铺开，辅助生殖技术的需求量逐渐增加，双胎妊娠发生率也相应上升。目前，在中国双胎妊娠发生率已达到2%。双胎妊娠新生儿染色体非整倍体病的风险远比单胎妊娠高[17]，并且筛查受各种因素的影响，是临床研究的热点和难点。双胎妊娠单纯使用母体血清学筛查存在一定的局限性，因检测的假阳性率高导致需进行双胎羊膜腔穿刺检查的可能性增大，最高可达18.3%[18]，进而提高了由于侵入性产前诊断导致的孕妇流产概率，所以，一般并不建议对双胎妊娠单纯开展血清学检查。NIPT技术在自然单胎妊娠中的筛查研究现已获得应用，但在双胎妊娠中使用的文献报道却极少见。因没有大样本的调查，检测的准确率尚不清楚，双胎妊娠在国内孕妇外周血cffDNA产前筛查和诊断技术规范中属“慎用人群”。SARNO等[19]研究表明，417例双胎妊娠中21-三体检出率为100%(8/8)，18-三体或13-三体检出率为60.00%(3/5)，假阳性率为 0.25%(1/404)。一项纳入35项NIPT相关研究的meta分析结果显示，在双胎妊娠中对21-三体综合征的筛查发现，共有24例21-三体和1 111例非三体性21号染色体异常，总检出率为100%(95%可信区间：95.2～100.0)，假阳性率为0(95%可信区间：0.000～0.003)[20]。双胎妊娠母亲血浆中具有2个胎儿的游离DNA，但不能识别，且影响因素较复杂。有研究表明，双胎妊娠NIPT检测的准确性与cffDNA水平，即“胎儿分数 ”有关[21]。单卵双胎在cffDNA总数约为4%后即可达到测定条件，且遗传物质水平与单胎一致。而双卵双胎染色体核型通常并不相同，如异常cffDNA少而正常cffDNA水平高，检测结果可能因正常胎儿“掩盖”了异常胎儿而提示为低风险造成假阴性。YU等[22]发现，双胎之一死亡是引起NIPT假阳性的主要因素，异常胎儿死亡后孕妇外周血中仍存在着死亡胎儿的游离DNA，该影响至少持续7～8周，但不超过12～14周，所以，双胎之一死亡消失时建议直接产前诊断而不是产前筛查。另有研究表明，双胎妊娠中cffDNA与母亲血浆DNA比率远不及单胎妊娠，中位数分别为8.0%、11.0%；而NIPT检测中双胎妊娠重采率也比单胎高，第1次抽样后失败率双胎和单胎分别为9.4%、2.9%[19]。NIPT检测双胎、辅助生殖助孕胎儿21、18、13-三体综合征具有一定的可行性，但仍存在假阳性，筛查高风险需进一步进行介入性产前诊断，且双胎妊娠检测失败率，以及筛查低风险孕妇死胎、流产等异常妊娠结局发生率均高于单胎妊娠，因而检测的后续处理和遗传咨询尤为重要[23]。

1.3染色体微缺失、微重复 染色体微缺失/微重复综合征是一类由于CNV-seq所致的具有复杂表型的综合征性病症，是造成新生儿出生缺陷的主要遗传性原因之一。据统计，在不明病因的儿童智力下降、多发畸形和生长/发育延迟中约有12%是由染色体中的微缺失/微重复引起的。2011年PETERS等[24]在新英格兰杂志报道了1例通过NIPT方法检出的在12p11.22-p12.1之间4.2 Mb的微缺失，并通过介入性产前诊断证明了该胎儿的染色体微缺失遗传自其患有Asperger′s综合征的母亲，可导致生长/发育迟缓和多发畸形的临床表型。说明NIPT不仅对常见染色体非整倍性，而且对CNV的检测均具有潜在意义，但这种最新方法仍处于起步阶段。一项纳入42 910例单胎妊娠的研究结果显示，NIPT检测染色体微缺失/微重复的PPV为28.99%，其中CNV≤5 Mb的PPV为20.83%，5～10 Mb的PPV在50.00%以内，>10 Mb的PPV为27.27%[25]。另有研究采用NIPT检查了8 141例单胎妊娠，结果显示，51例(0.63%)染色体微缺失或微重复的筛查高风险病例，但只有13例(36.11%)经产前诊断确诊为阳性病例[26]。有学者利用算法优化以增加分析的灵敏度，如CHEN等[27]开发了一种实用的胎儿CNV分析方法，通过低覆盖全基因组测序(约0.08倍)检测大于10 Mb的胎儿染色体缺失/重复，在1 311例样本中检测到4个样本的缺失/重复，范围为9.01～28.46 Mb，检测大于10 Mb染色体缺失/重复的灵敏度和特异度分别为100%、99.92%。WAPNER等[28]则针对目标区域基于单核苷酸多态性技术的 NIPT 方法对358例孕妇血浆样本检测了5种微缺失综合征，其中胎儿22q11.2 缺失的检出率为 97.8%，假阳性率为 0.76%，其余 4 种综合征(1p36缺失、Cri-du-chat综合征、Angelman综合征、Prader-Willi综合征)的检出率均为 100%。此后国内外多家机构扩展了NIPT的分析技术领域，增加了CNV-seq检测，即NIPT-Plus。近期中国一项共有94 085名单胎妊娠妇女参加的大型NIPS-Plus临床研究结果显示，对已知微缺失/微重复综合征(32例)、DiGeorge综合征的PPV为93%，22q11.22微重复的PPV为68%，Prader-Willi/Angleman综合征的PPV为75%，Cri-du-Chat综合征的PPV为50%；对剩余的全基因组微缺失/微重复综合征(88例)组合的PPV为32%(CNV≥10 Mb)和19%(CNV<10 Mb)[29]。可见，NIPS-Plus对DiGeorge综合征具有较高的PPV，对其他染色体微缺失/微重复综合征的PPV则没有那么高。

1.4单基因遗传病 单基因遗传病是由于一对等位基因突变引起且遗传上遵循孟德尔遗传定律的病症，因而也称为孟德尔遗传病。截至2020年，人类孟德尔遗传数据库在线上公布的表型和分子机制已知的单基因遗传病为5 947种。国外统计数据显示，出生缺陷中染色体异常占6%，而单基因遗传病占7.5%，所有单基因遗传病的累积发病率高达1%，是出生缺陷的主要原因。检查新生儿单基因遗传性疾病最直接的手段就是对胎儿组织或细胞的检查，如通过羊水穿刺或绒毛层取样进行有创性产前诊断。目前，通过cffDNA对单基因遗传病进行检测的技术开展受到限制，主要由于以下3种原因：(1)孕妇血浆中存在大量母源DNA信息的干扰，若cffDNA水平又偏低则胎儿DNA信息将因母源性变异而无法检测；(2)母体外周血中cffDNA水平很低，导致无法检出结果或造成假阴性与假阳性结果；(3)由于不同型单基因病致病原因的复杂程度不同，因而检测的策略各有差异，大多数单基因遗传病的无创检测均需依赖于先证者样本构建胎儿单倍体型。从检测技术上看，基于cffDNA的单基因病检测其发展大致经历了从PCR、荧光定量 PCR、数字PCR、低深度二代测序到现在的高深度二代测序过程。目前，对利用cffDNA检查胎儿单基因病变的研究重点主要聚焦于对常染色体遗传疾病及其X-连锁病变的检测，主要研究的疾病涉及地中海贫血、软骨发育不良、强直性肌肉营养不良、亨廷顿舞蹈症等14种人群患病率较高的病症。英国在单基因病无创产前诊断技术向临床转化方面做了许多工作并取得了成效，目前，已针对软骨损伤发育缺陷、致死性骨生长/发育缺乏、阿佩氏综合征、囊性纤维化、成纤维细胞生长因子受体基因相关的颅缝过早闭症等建立了无创产前诊断临床服务[30]。国内近期有研究表明，通过靶向捕获测序和单倍型辅助分析方法可实现无创产前诊断胎儿地中海贫血的基因型[31]。LI等[32]采用SHAPEIT软件构建了亲代单倍型，并对新生儿与遗传的父亲之间的单倍体型剂量应用相应定量分析的方法推断胎儿突变的遗传状态，成功构建了5个β-地中海贫血家庭的亲本单倍型并检测了遗传的亲本突变。

2 小 结

NIPT可能是一种潜在的SCA筛查方法，筛查X-染色体单体的真实阳性率较低，而对其他SCA的预测相对准确。X-染色体变异的孕妇可能会影响cffDNA产前筛查结果，因而不建议对已知X-染色体变异孕妇进行NIPT。按规范标准管理方法和规范操作进行，NIPT的双胎21、18、13-三体综合征存在一定的有效性，但因没有大量的临床使用结果，其应用价值尚有待于进一步研究。根据目前的研究进展和指南意见分析，以NIPT的方式筛查研究结果较明确的5 Mb以上的胎儿CNV存在一定可行性，适用于 NIPT的临床检测范围有望拓展至21、18、13-三体综合征以外的染色体病。目前，单基因遗传病的NIPT研发总体仍处在科研探讨中，但各种方法仍需经过更大规模临床数据的检验，因此，测试方法及对整个测试系统的品质监管与监控均须进一步明确与细化方可用于临床研究。卢煜明博士队伍最近的研究结果显示，孕妇血浆中存有新生儿染色体外环状DNA，具有较强的生物稳定性和独特的分子特征，或将可能为迅速发展的NIPT研发领域创造出一个全新的生物标志物[33-34]。相信未来由于检测成本的下降和科技的提升，NIPT在产前检测领域将具备更加明显的技术优势和广泛的发展前景。