抗人类肠道病毒71药物及疫苗研究进展*

谢小晖，陈路路，李超英，郑惠丹，张 怡，陶 玲 综述，徐银兰△审校

(1.新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003；2.新乡医学院外语学院，河南 新乡 453003)

人类肠道病毒71(EV71)属肠道微生物群，是微小病毒科，归属于人类肠道病毒A。在肠道毒菌群中，EV71是迄今发现最晚的肠道病毒，主要引起5岁以下婴幼儿神经系统疾病，感染力强且致病率极高[1]。部分患者可出现脑水肿、脑炎、脑脊髓炎、循环衰竭等较为严重的脑部疾病。1981年在我国上海发现该病毒，1987年EV71在香港流行，于2008年1月至2019年6月中国疾病预防控制中心建立的手足口病监测系统报告了2 254万例手足口病病例，导致3 704例患者死亡[2]。

目前，据文献报道，EV71已有6种基因型，在中国流行的主要是A、B、C型。EV71为二十面体立体结构的单股正链RNA病毒，无包膜和突起球形结构，直径为24～30 nm，基因组大小为7.4 kb。肠道病毒EV71的复制周期包括吸附、进入、脱壳、蛋白翻译、多聚蛋白加工、基因组RNA复制及病毒组装和释放。现将目前EV71的治疗与预防研究现状综述如下。

1 抗EV71药物研究进展

1.1抑制病毒复制过程 利巴韦林属于人工合成的核苷类广谱抗病毒药物，作用位点为病毒核糖核酸聚合酶。利巴韦林可对次黄嘌呤脱氢酶产生抑制作用，加速细胞内三磷酸鸟苷库的消耗，使细胞内能量调控异常，直接对病毒翻译起始及肽链延伸阶段产生影响，抑制病毒核酸复制过程，与喜炎平联用可提高小儿手足口病治愈率，减轻临床症状，降低不良反应发生率[3]。然而利巴韦林的大量使用，导致药物不良反应发生率上升，临床表现多种多样，其中药物不良反应常见表现有恶心、呕吐、胸闷和瘙痒，目前已停止使用。瑞德西韦(RDV)是一种腺苷小分子类化合物，发挥抗病毒效果的形式为磷酸化的三磷酸，通过抑制病毒中RNA依赖性的RNA聚合酶活性从而发挥作用[4]。有研究发现，RDV可以识别并与一些病毒的RNA转录酶相作用，显著降低小鼠横纹肌肉瘤中的病毒载量[5]。药物发挥作用也能通过阻断EV71复制过程中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路来实现，WANG等[6]发现的延胡索碱在一定浓度范围内可抑制p38-MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)-MAPK信号通路，造成环加氧酶2表达量发生变化，进而发挥抗EV71感染的作用。3D蛋白酶又称为依赖于RNA的RNA聚合酶，是EV71基因组复制的关键酶。2′-脱氧-2′-β-氟-4′-叠氮胞苷是一种小核苷类似物抑制剂，通过靶向竞争EV71 3D蛋白酶抑制EV71的复制及RNA的合成，体外抗病毒活性显著。每2天用1 mg/kg剂量进行1次2′-脱氧-2′-β-氟-4′-叠氮胞苷治疗可显著增强小鼠对EV71的抵抗力，降低小鼠组织中EV71载量，对小鼠起到很好的保护作用[7]。

1.2抑制病毒翻译过程 EV71的翻译过程依靠内部核糖体进入位点(IRES)，其是病毒翻译过程中的关键位点，黄酮类化合物山萘酚能抑制病毒依赖的IRES的翻译过程，降低IRES水平发挥抗病毒作用。作为一种黄病毒抑制剂，腺苷类似物NITD008能阻断病毒RNA的合成，具有强大的抗EV71作用。NITD008在体外对几种杯状病毒表现出低毒性，低浓度即可产生较强的抗病毒活性，该化合物作为治疗开发的支架将具有相当大的益处，具有广泛的应用前景[8]。

1.3抑制EV71多聚蛋白关键酶 3C蛋白酶是EV71结构的关键酶，首先EV71基因组会翻译出多聚蛋白，3C蛋白酶需要对合成后的多聚蛋白进一步切割加工，使多聚蛋白成为更小的结构蛋白和非结构蛋白，同时，其还可诱导细胞凋亡并帮助EV71逃避宿主免疫系统的追杀。槲皮素是一种类黄酮化合物，对多种病毒具有抗病毒活性，槲皮素可使EV71 3C蛋白酶活性降低，同时，不影响其他关键酶的活性。YAO等[9]研究表明，在横纹肌肉瘤和Vero细胞中槲皮素会出现低细胞毒性，50%组织细胞感染量大于200 μm，与利巴韦林比较，槲皮素有更好的抗EV71活性和更低的细胞毒性作用。EV71 3C蛋白酶抑制剂——NK-1.8k是近年来研发的抗EV71药物，EV71 3C蛋白酶结构是一种开放性构象，与其他小RNA病毒的结构有所差异。NK-1.8 k与EV71 3C蛋白酶中的活性位点发生反应，使3C蛋白酶无法发挥其功能，能较好地抑制EV71活性，抗EV71效果显著[10]。EV71 2A蛋白酶主要参与多蛋白的加工、抑制宿主蛋白合成、逃避先天免疫和诱导细胞死亡等，以目标2A蛋白基因为目标序列合成的小干扰RNA(SiRNA)可专一地作用于2A蛋白酶，进而产生抗EV71的作用。当SiRNA浓度为60 nm时能让EV71感染细胞达到最高的转染效率，用SiRNA-2Apro处理后病毒蛋白含量和RNA含量均会明显低于对照组[11]。

1.4抑制病毒脱衣壳 EV71 VP1蛋白是其关键蛋白，具有EV71标志物的作用，抗原识别位点也于此处。普可那利是一种广谱抗肠道病毒和鼻病毒药品，作为病毒衣壳结合剂能与VP1蛋白结合，抑制其构象的改变及EV71进入宿主细胞的过程，但存在很大的安全性问题。LI等[12]基于普可那利的母核设计出的DBPR103安全浓度较高。灵芝的活性成分有很多，如有机酸、氨基酸等，其主要活性成分为灵芝三萜。灵芝三萜类化合物可与EV71颗粒相互作用，阻断EV71的吸附过程，破坏病毒的脱衣壳过程。

1.5抑制病毒的吸附和穿入 两性霉素B与附着物相作用，抑制EV71在细胞中的内化过程，清道夫受体Ⅱ是EV71的细胞受体，能感染人体细胞，在病毒的早期感染中发挥关键作用。JIN等[13]构建的EV71小鼠模型中小鼠脑组织和脊髓在病毒感染后7 d呈现出局灶性变化，神经细胞和胶质细胞的变性增生，炎性反应强烈。ZHANG等[14]构建了一种抗人类清道夫受体2(SCARB2)的单克隆抗体，称为JL2。JL2单克隆抗体对EV71的感染具有抑制作用，通过3个螺旋α2、α5、α14与人类SCARB2 结合，抑制EV71的吸附与穿入过程。阿卡波糖作为一种潜在的药物，可有效阻断EV71从肠道向全身的动态转移，FENG等[15]研究表明，小肠被证实是EV71感染部位，回肠是EV71在小鼠体内增殖和运输部位，阿卡波糖通过抑制EV71与细胞表面受体的结合发挥抗EV71作用。

1.6天然化合物 传统中草药价格低廉，易于获得，便于培植，还具有广谱抗病毒优点。很多中药单体均是天然化合物，抗EV71作用较好。使用中草药发挥抗病毒的效果将会是一个广泛的应用前景。开发和研究传统中草药抗EV71作用具有重要的临床实用意义。

1.6.1姜黄素 姜黄素是姜黄的主要活性成分，具有许多方面的作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等，还拥有较为广泛的抗病毒活性。姜黄素广泛使用在临床中医药治疗中，由于具有抗氧化等特性，在抗感染、抗肿瘤、抗病毒感染中发挥作用[16]。姜黄素具有显著的抗病毒效应，可抑制猪圆环病毒2型(PCV2)诱导的线粒体凋亡，降低细胞凋亡率，缓解PCV2诱导的线粒体凋亡[17]。姜黄素不调节EV71的吸附与内化过程，仅可以对EV71的复制具有抑制作用，与α干扰素(IFN-α)联用可显著增强IFN-α的抗EV71活性。有研究发现，EV71会降低SH-SY5Y细胞中I型干扰素受体水平，姜黄素通过抑制SH-SY5Y细胞中干扰素受体水平的降低增强IFN-α的抗EV71活性[18]。

1.6.2苦参碱 苦参始于神农本草经，含有多种化学成分，其主要成分为苦参碱和氧化苦参碱。在传统医学的观点中苦参具有多种药理学作用，如清热燥湿、利尿、杀虫等作用，现代研究表明，苦参除以上作用外，还可改善心律失常，以及抗病毒、抗瘤等作用[19]。苦参碱对EV71具有预防作用，安全范围较好，较低浓度可预防EV71感染，并且能对EV71的活性有很好的抑制作用。XU等[20]研究表明，苦参碱与蛇床子素联合使用可通过降低PCV2降解物激活蛋白的表达共同抑制PCV2导致的细胞凋亡。

1.6.3莪术醇 莪术醇是从莪术根中提取的一种天然化合物，莪术醇具有多种生物学活性，已用于治疗心肌炎，且可用于抑制脑心肌炎病毒活性。有研究发现，与利巴韦林阳性对照组比较，莪术醇抑制率明显高于利巴韦林，安全浓度较高。莪术醇可增加T淋巴细胞内IFN-β蛋白的表达，从而对脑心肌炎病毒的活性产生抑制作用[21]。

1.6.4黄芩苷 黄芩苷是黄芩的主要活性成分之一，具有优秀的抗炎作用，还可调整线粒体诱导的细胞凋亡途径，使活化的T、B淋巴细胞加速凋亡。黄芩苷对脑心肌炎病毒的最大抑制率高于利巴韦林，同时，选择性指数低于阳性对照组，说明黄芩苷具有良好的抗病毒活性[22]。

1.6.5片仔癀 片仔癀具有显著的抗病毒、抗肿瘤作用，在抗EV71体外感染过程中可有效抑制多种EV71毒株的活性，抑制病毒绿色荧光蛋白质的表达，降低EV71的感染能力[23]。在病毒吸附前使用槐啶碱可增加细胞对EV71的抵抗力。

1.6.6金银花 喂食金银花提取物或接种micoRNA-let-7a的EV71感染的吸吮小鼠，表现出临床评分降低和存活时间延长等特点，伴有病毒RNA、蛋白表达和病毒滴度降低[24]，表明金银花水提取物可抑制EV71在体内、外的复制。

1.7抗氧化物 氧化应激可增强病毒复制能力，EV71感染会诱导宿主细胞氧化应激能力的提升，从而增强病毒的侵袭能力，故抑制机体氧化应激可抑制EV71的感染。

1.7.1薄荷 薄荷可清热解毒，同时，具有药理作用广、毒性低、成本低廉等优点，因此，薄荷的应用价值是多种多样的。薄荷的成分众多复杂，具有抗氧化作用，其普列薄荷成分具有广泛的抗癌作用[25]。

1.7.2灵芝类 近年来，以二氧化碳超临界萃取法制备的灵芝孢子油作为一种新型产品而出现，具有抗脑缺血再灌注损伤和抗氧化、清除自由基等功效，作为灵芝主要活性成分的灵芝三萜是从灵芝菌丝中产生的代谢产物，具有抗病毒、抗癌活性。

1.7.3芦丁 芦丁是一种类黄酮类化合物，广泛分布于各种常见物质中，如水果、蔬菜等，具有一系列广泛的作用，如抗氧化、抗病毒、抗癌等[26]。芦丁衍生物的药理活性很多，MECENAS等[27]合成的芦丁乙酸酯具有很好的抗氧化性，可降低感染细胞的氧化应激能力和活性氧含量，且对哺乳动物无毒。

1.7.4漆黄素 漆黄素是一种较常见的类黄酮多酚物质，广泛分布于水果、黄栌、蔬菜和漆树中。漆黄素分子结构中存在自由的羟基和羰基具有良好的抗氧化作用，可通过多酚氧化酶发挥自由基清除作用，也可抑制活性氧生成，保护细胞[28]。

1.8细胞因子 肿瘤坏死因子-α是一种功能强大的细胞因子，在免疫活动中具有强大的适应性，促炎细胞因子——肿瘤坏死因子-β参与了多种炎症、抗病毒和免疫刺激反应。白细胞介素-4由先天淋巴细胞如自然杀伤T细胞和髓样细胞(如嗜碱性粒细胞和肥大细胞)产生，是2型免疫反应的标志性细胞因子，也具有非免疫功能[29]。

2 疫苗研究进展

防控EV71最有效的措施还是注射疫苗，抗EV71的疫苗主要包括以下几种。

2.1减毒活疫苗 减毒活疫苗是将完整病原体进行活疫苗的减毒，可诱导细胞免疫及体液免疫，给机体带来更长久的保护，但存在多种安全性问题。

2.2灭活疫苗 灭活疫苗是将病原体灭活得到的疫苗，相比于减毒活疫苗，不良反应较小，产生抗体的能力强，有效性和安全性较好。2015年我国成功研制出EV71全病毒灭活疫苗，并于2016年开始投入使用[30]，在后期的临床调查中发现，被观察者体内干扰素、白细胞介素、免疫球蛋白G等水平均得到上调，疫苗的保护周期长、安全性高、免疫原性强[31]。FAN等[32]研发的二价灭活EV71/柯萨奇病毒A16型(CA16)疫苗可使小鼠体内免疫相关趋化因子表达上调，可提高小鼠对EV71、CA16感染的有效免疫力。

2.3病毒样颗粒(VLP)疫苗 YANG等[33]在毕赤酵母中制备了EV71 VLP疫苗，当EV71 VLP为每剂1～5 μg、佐剂为每剂225 μg时可引发强大的保护性中和抗体反应，并针对小鼠提供强有力免疫屏障。WANG等[34]发现，接种在皮基亚牧羊犬中产生的重组EV71样颗粒疫苗小鼠的免疫血清也表现出对EV71异源亚型的交叉中和活性。LUO等[35]制备的EV71 VLP及其嵌合体疫苗可诱导机体产生较强的免疫应答，保护小鼠抵抗致死性EV71、CA16感染。

3 小 结

预防EV71感染，疫苗防控仍是目前的主流手段，但安全性问题较多，保护效果不佳，存在毒力恢复等安全性问题，且大多数疫苗均是针对的EV71 C4亚型，加之目前尚无特效药品治疗EV71感染，现在使用的药物多少均存在着一些不良反应，有些药物还容易引起病毒的耐药性，开发新的、不良反应少的抗EV71药物迫在眉睫。传统中草药具有价格低廉、易于获得、便于培植、广谱抗病毒等许多优点。天然化合物的联合使用可减少病毒耐药性的产生，还可减少药物用量，可能成为新的抗EV71的研究方向。