微管抑制剂在血管新生性疾病中的作用机制研究进展

方思尹，刘 辰，吴晋晖

1.海军军医大学第一附属医院 眼科, 上海 200433；2.海军军医大学第三附属医院 眼科，上海 200438

血管新生(angiogenesis)受多种细胞和因子调控，表现为血管基膜及血管外基质降解, 内皮细胞增殖迁移，最后生成新血管的过程。正常的血管系统是一个严密的网络，而病理性血管表现分布不均匀、形态不规则，周边缺乏周细胞和适当的基膜。相比较于正常血管，新生血管不成熟且更加脆弱。在生理情况下, 血管新生对恢复血供和促进伤口愈合起到积极作用，而病理性血管生成则是各种缺血性和炎性疾病的标志。血管生成异常与70多种疾病的发生、发展密切相关，如肿瘤、类风湿性关节炎、心血管疾病、眼部疾病和其他疾病等[1]。通过抑制新生血管生成或阻断新生血管，治疗血管生成异常相关疾病已成为研究热点。本文综述了微管抑制剂在新生血管性疾病中抑制血管生成的机制。

1 微管的结构及生物学作用

微管是真核细胞骨架的重要组成部分，由α和β微管蛋白的异源二聚体组装成长空心聚合物，宽25 nm，长1～100 nm，异源二聚体被称为微管蛋白二聚体，简称为微管蛋白，可通过α、β-异源二聚体聚合与解聚合的动态平衡发挥作用。微管在生长和收缩阶段之间自动切换的状态，称为动态不稳定性[2]。除了在细胞有丝分裂中起作用外，微管还密切参与各种细胞生理活动，例如，维持细胞形态和细胞运动及细胞器和囊泡的运输等。

2 微管抑制剂及种类

目前已知的微管抑制剂可分为两类：一类是促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂，代表药物为紫杉醇类化合物；另一类是抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂，代表药物有长春碱类化合物和秋水仙碱类化合物。1932年，首次报道了可口服的微管蛋白结合剂——秋水仙碱，这种药物可以提高一组癌症患者的短期生存率[3]。由于秋水仙碱的副作用较大，限制了其在临床上的广泛应用。近年报道，微管抑制剂可抑制新生血管形成和破坏现有血管，对病理性新生血管内皮有一定的选择性[4]。相对来说, 新生的血管内皮细胞的细胞骨架系统不完整，对此类药物较敏感[5]。将微管抑制剂作为新生血管性疾病的新治疗靶点已引起人们重视，越来越多的高效低毒的微管抑制剂被合成, 其中一些已经进入临床试验，但其对新生血管的作用机制尚不清楚。

3 微管抑制剂抑制新生血管生成

3.1 通过抑制血管内皮细胞功能抑制新生血管生成

血管内皮细胞发挥其功能依赖于多种细胞因子及基因表达，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种血管生成的诱导剂，能促进血管内皮细胞的存活、增殖和迁移，增加血管内皮细胞的渗透性，最终促进血管生成。已证实在各种类型的新生血管性疾病中VEGF过度表达，成为一种重要的抗血管生成的治疗靶点。另c-Myc基因可以与VEGF协同促进血管内皮细胞增殖，其过度表达常见于各种肿瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌及视网膜母细胞瘤等。

天然产物combretastatin A-4(CA-4)及其衍生物是一种极具研究意义的天然微管抑制剂，可通过抑制VEGF和c-Myc基因，抑制人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖、迁移、及其有丝分裂过程。CA-4及其衍生物通常对VEGF基因有较高的抑制活性，其中化合物 L-Met可下调VEGF基因的表达超过55%。大多数衍生物对于c-Myc基因也有显著作用，例Fmoc-L-Ala的衍生物，可将该基因表达降低22%。还有不少衍生物，如Fmoc-L-Ala、Fmoc-L-Phe及L-Thr对VEGF和c-Myc基因下调表达可超过60%[6]。另一种人工合成的CA-4衍生物CPU-XT-006也能有效抑制VEGF诱导的HUVEC的增殖，并减少细胞内VEGF的分泌，降低微血管的通透性来实现抑制新生血管生成[7]。

成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种碱性蛋白质，该因子具有促进血管内皮细胞有丝分裂和促进血管生成的作用，与其特异性受体结合，激活血管内皮细胞内酪氨酸蛋白激酶，从而促进细胞代谢和增殖。甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)是一种微管解聚药物能有效抑制bFGF诱导的内皮细胞增殖，减少细胞内bFGF蛋白的分泌，从而抑制血管新生[8]。

Rho蛋白是一组低分子量GTPase的Ras超家族蛋白，具有GTP酶活性，在多种细胞中高表达，主要参与张力纤维形成和黏着斑复合体组装，在细胞骨架重组调控方面起重要作用。RhoA是协调f -肌动蛋白和细胞骨架中的微管相互作用的关键蛋白。CA-4在秋水仙碱位点与微管蛋白的结合可抑制微管蛋白聚合，激活RhoA。天然微管抑制剂Pretubulysin (PT)引起的微管分解亦可激活RhoA，激活肌动蛋白应力纤维的形成和收缩、促进血管内皮细胞间的连接分解和增加其通透性，破坏血管内皮细胞结构和抑制血管内皮细胞功能，从而发挥抑制新生血管的作用。磷酸化Combretastatin A4(CA4P)是CA-4的水溶性药物形态，可激活RhoA/ROCK/MLC通路，促进微管的分解，这与有其助于肌动蛋白重构和增加渗透性的报道相一致[9]。

微管抑制剂可抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和侵袭等功能，如名为9i[10]、7m[11]及28g[12]等微管抑制剂，对抑制HUVEC管状结构的形成、迁移和侵袭具有显著作用，并在斑马鱼模型上其对新生血管生成的也有抑制作用。

3.2 诱导内皮细胞凋亡及阻滞细胞周期。

YMR-65是一种具有良好抗癌活性的微管蛋白抑制剂，能与微管蛋白的秋水仙碱结合位点紧密结合，诱导血管内皮细胞凋亡[13]。合成类微管抑制2f诱导细胞凋亡作用呈现出剂量依赖性[14]，经过化学外壳装载后的紫杉醇(paclitaxel，PTX)可有效抑制肿瘤血管，细胞凋亡率超过65%，能显著减少血管的数量，导致肿瘤血管生长受限[15]。

一种新的合成型微管抑制剂SAR of novel 3-arylisoquinolinones，与秋水仙碱作用类似，能与微管秋水仙碱位点结合，抑制了微管蛋白聚合，有效地改变了微管组装和拆卸的动力学过程，导致细胞分裂暂停，细胞周期阻滞于 G2/M 期，并诱导细胞调亡，而抑制内皮细胞管样成形并进一步破坏已成形的管样结构，抑制新生血管的生长[16]。

HDAC抑制剂为一种新的杂交分子，可破坏微管网络，将血管内皮细胞阻滞于G2/M期，诱导线粒体膜电位塌陷，有效抑制HUVEC管样形成，增殖和迁移。在斑马鱼模型中显示出抗血管生成和抗转移活性[17]。

3.3 多种机制联合作用

TR-764是一种新型的微管蛋白聚合抑制剂，在 HUVEC和鸡胚绒毛尿囊膜模型及两种小鼠肿瘤模型上具有较强的抗血管生成活性。TR-764可与微管蛋白结合触发细胞骨架重排，导致毛细血管破裂、细胞通透性增加和细胞运动性降低。还可诱导Src和FAK去磷酸化，触发Rho激酶和特定分子的信号级联，导致Src和FAK失活，并使VE-cadherin/β-catenin解偶联的机制破坏黏附连接和局灶性黏连，并在低氧条件下显著降低HIF-1α、抑制bFGF对促血管生成活性[18]。TR-764通过多种机制联合，阻止血管发育和抑制新生血管生成。

MT189也是一种新型微管蛋白结合剂，在低氧或常氧条件下，可降低肿瘤细胞和内皮细胞中VEGF的表达和分泌。MT189可以抑制内皮细胞VEGFR2和下游Src的激活。MT189还通过抑制含有FAK、桩蛋白、纽蛋白和肌动蛋白的局灶性黏连的翻转来破坏内皮细胞-基质连接。抑制JNK后，可使得MT189介导的对内皮细胞迁移和分化的抑制、JNK激活、VEGF表达和分泌的减少以及Src和FAK磷酸化的减少。这些结果表明，MT189可能通过JNK-VEGF /VEGFR2信号轴减少内皮细胞增殖、迁移和分化来抑制血管生成[19]。

CYT997是一种合成化合物，可以抑制微管聚合，在体外具有高度有效的细胞毒性活性。CYT997将细胞周期阻滞在 G2/M期，并且激活Bcl-2磷酸化，同时促进细胞周期蛋白B1表达，促进细胞凋亡及自噬，还可通过增加HUVEC通透性破坏血管[20]。

许多微管抑制剂都可通过抑制血管内皮细胞增殖，并诱导其凋亡，但其具体机制尚未明确。

4 微管抑制剂阻断形成新生血管

病理性新生血管的特点是内皮细胞增殖率高，缺乏周细胞，基底膜异常，血管通透性增加，从结构上看，血管结构混乱不完整。在未成熟的病理性血管中，肌动蛋白微丝不发达，内皮细胞形状和血管的结构完整性更依赖于微管。微管的破坏可能会影响肌动蛋白的细胞骨架功能，导致病理性血管内皮失去完整性，从而减少肿瘤组织的血流量。大多数微管抑制剂通过破坏细胞骨架和细胞间连接来诱导内皮细胞形状的改变，可诱导肿瘤脉管系统发生快速血管阻塞和大量坏死[21]。

单剂量CA4P给药后，肿瘤血流在1h内减少，血管出现迅速、广泛和不可逆的闭塞和出血性坏死，大部分微小血管损伤，渗透压和组织间流体压力增加，血管直径显著减小。血浆渗漏还可增加血液黏度，导致血流减少。另一个导致血管关闭的因素是通过接触暴露的基底膜成分而激活血小板[22]。VE-cadherin是一种内皮细胞特异性钙黏蛋白，其功能是稳定细胞结构，参与钙依赖性细胞间黏附。CA4P可以破坏VE-cadherin的结合，并抑制VE-cadherin/Akt途径的信号转导。黏附体连接的破坏有助于内皮细胞聚集，增加毛细血管中血流的几何阻力和提高脉管系统渗透压[22]。 C118P是新合成的另一种CA4类似物，可影响HUVEC的微管动力学和其骨架，破坏已建立的血管网络，阻断已成形的血管[23]。

5 微管抑制剂的双重抗血管作用

微管抑制剂EHT 6706不仅抑制新生血管的形成，还破坏已形成的内皮毛细血管。EHT 6706抑制VE-cadherin/β-catenin复合物的功能，影响新血管组装和重塑过程。EHT 6706还可下调某些有利于血管生成的基因表达，如肝细胞源性生长因子 (hepatoma-derived growth factor，HGF)， 转化生长因子(TGFalpha)等基因；也可上调具有强效抗血管作用的基因表达，如ADAMTS9、COL4A1、FN1、TIMP2、NRP1、SPP1、Sema3F、PTPRM、PROX1和PGK1等[24]。

CA-4则可以影响内皮细胞的出芽和成管，从而抑制新生血管形成及破坏发育中的血管系统。CA4作用24 h后，导致发育的受精鸡蛋绒毛尿囊膜的血管系统不可逆地闭塞，鸡胚死亡率90%；其衍生物2e作用6 h后，可观察到小血管和毛细血管的破坏并出血。另CA-4还可抑制血管生长的关键步骤，即内皮细胞在基质胶上成管样生长[8]。C118P可抑制血管生成并破坏已建立的血管网络。此外，还可以诱导HUVEC细胞G2/M期细胞周期停滞和凋亡[23]。

6 问题与展望

对血管新生过程的进一步探索可以更加深入地了解其复杂的分子生物学机制，为临床药物的开发提供了依据和思路，揭示微管抑制剂抑制血管机制，有望为日后的治疗提供靶点。目前已有大量微管抑制剂显示出其强大的新生血管治疗作用，其中一部分已进入临床前试验，但其具体的作用机制尚不明确。在眼科领域，微管抑制剂治疗眼部新生血管性疾病仍存在空白。基础研究应用于临床治疗必须克服其作用效果受机体多个因素影响的障碍。