RhoGTP酶活化蛋白在上皮细胞间质转化中作用的研究进展

徐 倩，段 华，甘 露，刘麒薇

首都医科大学附属北京妇产医院 妇科微创中心，北京 100006

上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞在形态上发生向间(充)质细胞表型的转变,并获得迁移能力。在此过程中，极化的上皮细胞经历多种生化改变，表现出间质细胞表型，细胞迁移能力、抗凋亡能力及产生细胞外基质成分的能力增强[1]。近年来，RhoGTP酶活化蛋白(RhoGTPase activating protein，RhoGAP)对EMT过程中细胞表型转变及细胞迁移能力的调控越来越受到研究者的重视[2]。作为Rho家族小GTP酶的负向调节因子，RhoGAP可以参与调控细胞表面受体同肌动蛋白细胞骨架的信号传导，从而影响EMT相关的肿瘤细胞转移及纤维化疾病的转归，成为抗肿瘤及抗纤维化的潜在治疗靶点。本文就RhoGAP在EMT过程中的调节作用及相关机制的研究现状进行综述。

1 EMT与RhoGTP酶的关系

EMT主要包括3种类型：胚胎发育及器官发生相关EMT、组织再生及纤维化相关EMT、癌侵袭及转移相关EMT[1]。上皮细胞在胚胎发育过程中、受到炎性刺激或致癌因素刺激时，都可能发生EMT过程，分别转变为间充质细胞、成纤维细胞及具有转移特性的肿瘤细胞[3]。在发生EMT的上皮细胞中，细胞骨架改变，上皮细胞标志物E-钙黏素及γ-连环蛋白表达降低，同时，间质细胞标志物波形蛋白、N-钙黏素及纤连蛋白增多，基质金属蛋白酶类物质增多[4]。RhoGTP酶可以调节很多细胞的基础功能过程，包括细胞黏附、细胞迁移、囊泡转运及细胞分化[5]。其家族关键成员包括Rho、Rac和Cdc42。Rho可以对肌动蛋白应力纤维进行重新装配，并刺激细胞内肌动蛋白-肌球蛋白收缩；Rac可以诱导肌动蛋白表面突起即板状伪足的装配；Cdc42促进富含肌动蛋白的指状延伸即丝状伪足形成，并且调整细胞的非对称性。

在多种转移性癌细胞系中，肌动蛋白细胞骨架的解聚可以影响细胞大小，并提高细胞E-钙黏素的表达水平，表明肌动蛋白重构是发生EMT的上游调控因子[8]。因此，RhoGTP酶是胞内信号传导以及肌动蛋白细胞骨架调控中的重要分子开关，是EMT过程中的重要调节靶点[6]。

2 RhoGAP对EMT的调控作用

RhoGAP作为负向调节因子加速RhoGTP酶的水解，促进内源性GTP酶活化，使其更易于与GTP分离并结合GDP[7]，从而使RhoGTP酶由活性型-GTP限制型转变为失活型-GDP限制型。RhoGAP蛋白分子具有一个指状结构保守结构域,其带正电荷精氨酸可以进入GTP酶的催化基团，通过中和GTPγ-磷酸盐的负电荷发挥作用[8]。

RhoGAP失活足以引起Rho通路超活化，促进Rho介导的细胞改变进程，RhoGAP对RhoGTP酶活性的调节是此过程中的重要生理学机制[9]。RhoGAP在很多转移性癌类型中表达量下降，提示RhoGAP可能在癌侵袭及转移相关EMT中发挥调控作用。RhoGAP通过RhoGTP酶影响细胞内多条信号通路传导，调节细胞连接及肌动蛋白细胞骨架的各种成分，改变上皮细胞极性的稳定性，调控EMT过程，从而影响疾病转归。

人类RhoGAP分子的数量远远超过了其细胞内底物RhoGTP酶的种类,过量RhoGAP分子的存在提示RhoGAP分子在调节RhoGTP酶时具有特异性，这种特异性与RhoGTP酶催化基团外的氨基酸残基种类有关。如前所述，细胞中的肌动蛋白重构在EMT中发挥重要作用，其主要以3种形式存在：1)板状伪足，由相互交叉结合的肌动蛋白微丝形成网状结构组成；2)丝状伪足，由平行的肌动蛋白微丝形成指状结构组成，这是迁移细胞前缘的两种突出结构；3)肌动-肌球蛋白微丝束，多见于纤维母细胞，以应力纤维和弧状排列形式插入黏着斑复合物。RhoGAP即通过调节这些肌动蛋白组分进而参与EMT中的细胞表型转变及细胞迁移。以下对近年来研究较多的EMT相关RhoGAP进行综述。

2.1 肝癌缺失蛋白-1(deleted in liver cancer-1,DLC1) 与肿瘤转移

DLC基因1(DLC1)定位于人类染色体8p21.3-22，也叫做STARD12/ARHGAP7，其表达产物由1 091个氨基酸组成。其结构主要包括不育基序区域、RhoGAP和START(steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer，START)3个结构域。DLC蛋白家族主要通过负性调控Rho蛋白及其效应因子和调控黏着斑蛋白去磷酸化而发挥其生物学功能。DLC1起初被作为肝细胞癌的肿瘤抑制因子，后续研究发现其在很多人类肿瘤中都有缺失，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌及胰腺癌。

DLC1可以通过抑制TGF-β1通路传导从而调控CD105的表达，抑制非小细胞肺癌细胞的EMT转移过程，发挥抑癌作用[10]。高转移性的结直肠癌细胞外泌体miR-106b-3p与低转移性癌细胞共培养，其可以通过下调DLC1的表达，促进癌细胞上皮间质转化及转移、侵袭过程，说明DLC1能够通过调控EMT过程，发挥抑癌作用[11]。DLC1蛋白可以通过作用于EGFR/AKT/NF-KappaB通路上调E-钙黏素的表达，阻断鼻咽癌细胞的EMT过程，从而影响癌细胞转移[12]。表皮生长因子 (EGF)可以激活DLC1的GAP活性，经过磷酸化及去磷酸化作用，最终形成MEK/ERK-黏着斑激酶-DLC1-蛋白磷酸酶(PP2A)互作复合体，为细胞播散及细胞运动的时空调控提供新的检查点[13]。在转移性前列腺癌中，DLC1可以通过其RhoGAP作用机制提高E-钙黏素的表达水平，从而加强细胞集聚。以上研究均表明，DLC1可以通过负性调节Rho通路，改变肌动蛋白细胞骨架动力学，抑制细胞的EMT过程，提示其可能成为转移性癌的治疗靶点。

2.2 p190RhoGAP对RhoGTP酶的调节

p190RhoGAP家族蛋白是RhoGAP家族中研究较为广泛的一类GTP酶活化蛋白,可以被非受体蛋白酪氨酸激酶Src介导的酪氨酸磷酸化激活。p190RhoGAP家族蛋白包括两个成员：p190RhoGAP-A(p190-A)和p190RhoGAP-B (p190-B)，也分别叫做ArhGAP35、ArhGAP5，其基因分别定位于人类染色体19q13.3和14q12。作为RhoGAP家族重要成员之一，p190RhoGAP可以调节RhoGTP酶分子RhoA、Rac1以及Cdc42的活性状态，从而参与细胞骨架重构、细胞黏附、细胞极性维持、细胞增殖分裂及细胞迁移等过程，而这些过程也与肿瘤细胞的侵袭和转移有明显的相关性[14]。p190-A主要由3个区域组成：N端GTP结合区域、中部多个蛋白-蛋白互作区域以及C端GAP区域，并倾向于表现RhoA特异性结合。p190-A主要调节细胞迁移及多种细胞的肿瘤生成。p190-B主要在胚胎生成及发育过程中发挥作用，此外，p190-B对血管生成有重要的调节作用，且可调控 MMPs 的活性，促进细胞外基质的降解。

p190A可以逆转恶性肿瘤细胞的上皮间质转化过程，上调E-钙黏素的表达，通过调控Hippo通路，提高细胞接触抑制，从而抑制肿瘤细胞，发挥抑癌作用[15-16]。结直肠癌细胞系中，上调p190-B可以抑制RhoA蛋白的活性，改变E-钙黏素、N-钙黏素及波形蛋白的表达水平，进一步调控癌细胞转移[17]。叶酸可以增强cSrc和p190RhoGAP活性，降低RhoA活性，但ROCK抑制剂、cSrc抑制剂或p190RhoGAP沉默技术均可以逆转这种改变，提示叶酸可以通过叶酸受体/cSrc/p190RhoGAP/RhoA/ROCK信号通路抑制内皮细胞迁移。

2.3 肌球蛋白Ⅸ(myosinⅨ)负性调节Rho蛋白活性

人类表达两种myosinⅨ基因：myosin-Ⅸa (Myo9a)和myosin-Ⅸb (Myo9b)。与其他肌球蛋白不同的是，myosinⅨ的尾部有一个RhoGAP区域，负性调节RhoGTP酶活性，其特异性针对Rho调节，而非Rac1或Cdc42。Myo9a常见表达于成年人的睾丸及脑部；Myo9b则主要在免疫系统表达，在宿主防御功能中参与细胞骨架形态快速变化及能动性变化[18]。

细胞迁移需要细胞极化与收缩，并依赖于肌动蛋白的重构与动力学改变。Myo9b蛋白可以负性调节Rho蛋白的活性，白细胞中Myo9b蛋白的缺失可导致Rho活性增强，影响白细胞正常形态的维持，并影响白细胞的正常迁移能力[19]。局部加入Myo9b、Myo9b启动因子及GAP激活因子可以促进白细胞形态的恢复，并增强细胞的正常迁移能力，提示Myo9b可以通过影响局部Rho的活性而影响细胞运动能力。抑制Myo9b在破骨细胞中表达会导致细胞错位分布，酪氨酸激酶Src活性受到抑制，导致肌动蛋白细胞骨架重排，微管蛋白乙酰化缺失，影响微管的稳定性，提示Myo9b具有RhoGAP活性，可以作为肌动蛋白细胞骨架动力学改变的信号分子，进一步影响下游EMT过程。人类支气管上皮细胞的群体迁移时，使用RNA干扰技术抑制细胞内的Myo9a表达，发现细胞肌动蛋白细胞骨架发生重组，细胞间的黏附被破坏，新的细胞黏附结构无法建立，导致细胞分散，说明Myo9a对于细胞-细胞间黏附的建立及确保细胞群的群体迁移是必要的。缺乏Myo9a的细胞无法形成初始细胞连接，表型分散，常可导致创伤愈合受阻。在细胞水平上敲减Myo9a基因可导致细胞紧密连接闭合蛋白缺失，上皮细胞标志物E-钙黏素及β-连环蛋白的细胞局限定位遭到破坏，促进细胞的上皮表型改变。

2.4 多聚腺苷酸二磷酸核糖水解酶-1(poly ADP-ribose glycohydrolase，PARG1)对细胞生物学功能的影响

PARG1是由ARHGAP29基因编码一种GTP酶活化蛋白，其基因定位于人类染色体1p22.1，具有RhoA的GAP结构域，与RhoA具有很强的亲和力。

本课题组研究发现，上调小鼠子宫内膜细胞中ArhGAP29的表达，RhoA/ROCK1表达下降，并伴随间质细胞标志物表达降低，细胞纤维化程度改善，提示ArhGAP29可能参与了子宫内膜细胞的EMT纤维化过程[20]。ArhGAP29可以与Rasip1结合，影响Rap1(Ras相关蛋白1)诱导的细胞播散[9]。Rap1是原癌基因Ras超家族成员之一，具有广泛的细胞生物学功能, 可以调节细胞黏附、细胞-细胞外基质黏附以及肌动蛋白的重排，参与EMT的发展[21]。Rap1活化后，诱导Rasip1以及Radil-ArhGAP29复合物向细胞膜移动，从而形成Rap1-Rasip1-Radil-ArhGAP29复合物，通过这种蛋白移位以及多聚体的形成，抑制Rho信号通路，促进应力纤维形成，增强内皮细胞的屏障功能，改变细胞骨架结构。细胞张力的维持对于增强细胞屏障功能同样重要，环形肌动蛋白束需要 AF6、Cdc42及Cdc42GEFs的协同作用，与Rap1-Rasip1-Radil-ArhGAP29复合物共同发挥维持细胞骨架稳定的作用。

2.5 其他

FilGAP (ArhGAP24)是可以与细丝蛋白A结合的RhoGAP，其基因定位于人类染色体4q22.1，缺乏FilGAP的细胞迁移能力增强，反之则细胞极性增加，迁移能力降低，表明FilGAP抑制细胞能动性，增加细胞收缩及细胞极性。Rho家族小GTP酶对于上皮细胞的细胞黏着结合带形成非常必要。ARHGAP24可以通过STAT6-WWP2-p27信号通路抑制肺癌细胞增殖及细胞周期，并诱导细胞凋亡；相反，抑制ARHGAP24可以通过活化β-连环素的表达促进肺癌细胞的迁移和侵袭[22]。HOX 反义基因RNA髓系1蛋白(HOTAIRM1)可以通过调控miR-106a-5p，促进ARHGAP24的表达，进一步抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移[23]。亦有研究发现，FilGAP可以促进Madin-Darby canine kidney (MDCK)细胞间黏着结合带的形成。RNA沉默技术下调FilGAP表达后，可以促进MDCK细胞经肝细胞生长因子刺激后的播散和迁移。相反，过表达FilGAP会抑制细胞播散及迁移。

Cdc42 GTP酶活化蛋白(CdGAP/ArhGAP31)是富含丝氨酸及脯氨酸的GTP酶活化蛋白，可特异性激活Cdc42和Rac。其基因定位于人类染色体13q13.33，CdGAP蛋白充满带电荷的氨基酸及丝氨酸残基，并且具有PKC磷酸化区域和SH3结合位点。将CdGAP经显微镜注射到血清饥饿培养的纤维母细胞中，其可以抑制血小板源性生长因子诱导的板状伪足形成及缓激肽诱导的丝状伪足的生成，影响肌动蛋白细胞骨架重构,这些伪足的形成均需要经Cdc42 及 Rac介导。

Rich1 (ArhGAP17)属于Cdc42及Rac1特异性RhoGAP，其基因定位于人类染色体16p12.1。Rich1可以通过调控内皮细胞CDC42/RAC1-PAK1-ERK1/2信号通路和调整纤维肌动蛋白动力学特征来影响细胞周期、细胞增殖及黏着斑形成。Rich1对于细胞间紧密连接的维持非常重要，其可以结合细胞骨架蛋白Amot，通过细胞间紧密连接与胞内蛋白的沟通来维持细胞连接的完整性，减少细胞迁移的发生。

3 问题与展望

如何抑制肿瘤细胞的转移扩散及逆转组织纤维化病变是目前较为棘手的临床难题。EMT在肿瘤细胞侵袭及纤维化疾病的形成中起重要作用，很多研究者试图通过调整EMT过程中肌动蛋白细胞骨架结构及细胞连接来改善疾病预后。RhoGAP作为RhoGTP酶的重要调节因子，其对细胞骨架及细胞迁移、侵袭的影响已在多种疾病细胞系中得到证实[24]。但很多EMT及RhoGAP研究数据仅停留在体外细胞培养阶段，缺乏体内系统的评估。因此，EMT靶点药物数据多为初步探究阶段，需要更多的试验研究来验证RhoGAP对EMT的影响及作用机制。相信随着研究的不断深入，RhoGAP有希望成为EMT的治疗靶点，通过调节肌动蛋白细胞骨架重构及改变细胞迁移能力，逆转或减轻EMT病理过程，从而干预肿瘤侵袭与转移，阻断纤维化疾病的发展。