牛奶子枝叶的化学成分*

罗瑞龙， 李凤秋， 庄红丹， 王利勤

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

牛奶子(ElaeagnusumbellataThunb)为胡颓子科(Elaeagnaceae)胡颓子属(Elaeagnus)植物.胡颓子属植物在我国约有55种，全国各地均产，长江流域及以南地区更为普遍[1]，不少种的果实可食用或做果脯和果酱等果品加工原料，有些种的果、叶或根等可用于治疗肝炎、肠炎、痢疾、风湿性关节炎、哮喘及跌打损伤等[2].国内外对胡颓子属植物化学成分的研究集中于少数几个种，目前报道有三萜、黄酮、生物碱(β-咔啉类和羟吲哚类生物碱)等化学成分，对该属植物系统的研究相对较少.现有该属植物的活性研究大都以提取物作为研究对象，其表现出抗氧化、抗癌、抗炎、镇痛、抗菌、杀虫、降血糖和降血脂等多种生物活性[3].

牛奶子为亚热带和温带地区常见植物，分布于华北、华东和西南各省区，其果实可生食，也可制果酒和果酱等，叶可作土农药用于杀死棉蚜虫，其果实、根和叶亦可入药[1]，主治肺热咳嗽、泄泻和痢疾等[4].文献报道从牛奶子中已得到黄酮苷、三萜皂苷、木脂素、苯丙素苷和吲哚生物碱类成分[5-9].牛奶子枝叶中的山奈酚3-O-β-D-吡喃半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷和山奈酚3-O-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷对HaCaT角质细胞形成具有增殖效应[7]，山奈酚3-O-β-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷可降低炎症刺激下炎症细胞因子(IL-6和IL-8)的表达[9]，其余相关活性研究较少.为进一步研究牛奶子的药效物质基础，对采自云南省大理白族自治州的牛奶子枝叶化学成分进行了研究，利用多种色谱方法，结合波谱技术，从牛奶子枝叶乙醇提取物中分离鉴定了16个化合物(见图1)，包括4个倍半萜、4个三萜、3个木脂素、1个黄酮和2个甾体，除化合物14和15外，其余化合物皆为首次从该植物中分离得到.

1 仪器与材料

薄层色谱(GF254)和柱色谱硅胶(粒径74～154 μm和54～74 μm)为青岛谱科分离材料有限公司生产；凝胶Sephadex LH-20为瑞士GE Healthcare公司生产；MCI(粒径75～150 μm)为日本三菱化学公司生产；高效液相色谱仪为美国安捷伦Agilent-1260型，高效色谱柱为美国安捷伦公司RP-18柱(4.6×150 mm分析柱和9.4×250 mm半制备柱,粒径5 μm,)；所用核磁共振仪为Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振仪；显色剂为10%硫酸乙醇溶液；提取分离用溶剂均为工业级，经重蒸后使用.

牛奶子枝叶于2019年7月采自云南省大理白族自治州剑川县，经云南省中医药大学李宏哲博士鉴定，标本(标本号为EA1901)存于云南师范大学化学化工学院.

2 提取与分离

牛奶子的干燥枝叶(12.2 kg)粉碎后用95%的工业酒精室温浸泡提取5次，合并浓缩得浸膏685 g，浸膏溶于水后用乙酸乙酯萃取5次，得到萃取物135 g，该萃取物经硅胶柱层析(乙酸乙酯-石油醚，体积比1∶10、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、1∶0梯度洗脱，最后用100%甲醇洗脱)，TLC检测合并得到8个组分(Fr.1～8).Fr.2(3.4 g)组分经硅胶柱色谱(石油醚-乙酸乙酯，体积比10∶1)得到无色针状结晶化合物15(50 mg).Fr.3(9.7 g)经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯，体积比10∶1)得到5个组分Fr.3a～Fr.3e；Fr.3c经反复硅胶柱层析得化合物9(11 mg)；组分Fr.3d经反复硅胶柱色谱得化合物8(8 mg).Fr.4(6.7 g)经MCI柱色谱(甲醇-水，体积比6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、9.5∶0.5、10∶0梯度洗脱)得到8个组分Fr.4a～Fr.4h；组分Fr.4c经硅胶柱色谱和半制备高效液相色谱(甲醇-水，体积比54∶46)得化合物1(8 mg,tR=6.0 min)、2(6 mg,tR=7.3 min)、3(16 mg,tR=12.4 min)和4(12 mg,tR=6.6 min).Fr.6(10.9 g)经MCI柱色谱(甲醇-水，体积比6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、9.5∶0.5、10∶0)得到8个组分Fr.6a～Fr.6h；组分Fr.6b经凝胶柱色谱(甲醇)和硅胶柱色谱得化合物10(18 mg)；组分Fr.6c经硅胶柱色谱得化合物12(8 mg).Fr.7(9.4 g)经MCI柱色谱(甲醇-水，体积比6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、9.5∶0.5、10∶0)得到9个组分Fr.7a～Fr.7i；组分Fr.7b经硅胶柱色谱得化合物13(10 mg)；组分Fr.7c经反复硅胶柱色谱得化合物11(16 mg)；组分Fr.7f(189.7 mg)经过凝胶柱色谱和硅胶柱色谱得化合物5(26 mg)；组分Fr.7h经凝胶柱色谱和硅胶柱色谱得化合物7(8 mg)；组分Fr.7i经硅胶柱色谱得化合物6(10 mg).Fr.8(46.9 g)经硅胶柱色谱(甲醇-氯仿，体积比1∶10、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2、1∶1、10∶0梯度洗脱)、MCI柱色谱(甲醇-水，体积比6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、9.5∶0.5、10∶0)、凝胶柱色谱(甲醇-氯仿，体积比1∶1)和硅胶柱色谱得化合物14(12 mg)和16(11 mg).

3 结构鉴定

化合物1，白色固体，positive ESI-MS:m/z245[M+Na]+，分子式为C13H18O3.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：0.99(3H，s，H-11)，1.04(3H，s，H-12)，1.87(3H，d，J=1.3 Hz，H-13)，2.28(3H，s，H-10)，2.27，2.58(each 1H，d，J=17.0 Hz，H-6)，5.91(1H，t，J=1.0 Hz，H-2)，6.41(1H，d，J=15.8 Hz，H-8)，7.01(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：200.8(C-1)，128.1(C-2)，164.8(C-3)，80.1(C-4)，42.8(C-5)，50.6(C-6)，24.8(C-11)，19.3(C-12)，23.6(C-13)，148.5(C-7)，131.8(C-8)，200.5(C-9)，27.7(C-10).以上波谱特征与文献[10]报道基本一致,化合物1鉴定为4-羟基-4-(3-氧代-1-丁烯基)-3,5,5-三甲基环己-2-烯-1-酮(4-hydroxy-4-(3-oxo-1-butenyl)-3,5,5-trimethylcyclohex-2-en-1-one).

化合物2，白色固体，positive ESI-MS:m/z247[M+Na]+，分子式为C13H20O3.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：0.93(3H，s，H-12)，1.15(3H，s，H-11)，1.16(3H，s，H-13)，1.25(1H，m，H-2b)， 1.55(1H，m，H-2a)，1.62(1H，dd，J=9.2，14.3 Hz，H-4b)，2.33(1H，m，H-4a)，2.25(3H，s，H-10)，3.73(1H，m，H-3)，6.15(1H，d，J=15.8 Hz，H-8)，7.20(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：36.2(C-1)，47.7(C-2)，64.5(C-3)，41.4(C-4)，68.9(C-5)，70.9(C-6)，145.6(C-7)，133.9(C-8)，200.4(C-9)，25.2(C-10)，29.9(C-11)，27.5(C-12)，20.1(C-13).以上波谱特征与文献[11]报道基本一致，化合物2鉴定为(3S,5R,6S,7E)-5,6-环氧-3-羟基-7-大柱香波龙烯-9-酮((3S,5R,6S,7E)-5,6-epoxy-3-hydroxy-7-megastigmen-9-one).

化合物3，白色固体，positive ESI-MS:m/z231[M+Na]+，分子式为C13H20O2.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：1.02(3H，s，H-12)，1.05(3H，s，H-11)，1.25(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)，1.96(3H，s，H-13)，2.07(1H，d，J=16.8 Hz，H-2b)，2.42(1H，d，J=16.8 Hz，H-2a)，2.69(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，4.30(1H，m，H-9)，5.60(1H，dd，J=9.2，15.4 Hz，H-8)，5.72(1H，dd，J=5.8，15.4 Hz，H-7)，5.90(1H，s，H-4)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：37.2(C-1)，48.4(C-2)，202.1(C-3)，126.2(C-4)，166.1(C-5)，55.7(C-6)，127.3(C-7)，140.3(C-8)，68.7(C-9)，23.9(C-10)，28.2(C-11)，27.3(C-12)，23.8(C-13).以上波谱特征与文献[12]报道基本一致，化合物3鉴定为(6R,7E,9R)-9-羟基-4,7-大柱香波龙二烯-3-酮((6R,7E,9R)-9-hydroxy-4,7-megastig madien-3-one).

化合物4，白色固体，positive ESI-MS:m/z219[M+Na]+，分子式为C11H16O3.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：1.29(3H，s，H-10)，1.48(3H，s，H-9)，1.55(1H，dd，J=3.7，14.4 Hz，H-2a)，1.75(1H，dd，J=3.7，13.5 Hz，H-4a)，1.78(3H，s，H-11)，2.01(1H，dt，J=2.6，14.4 Hz，H-2b)，2.44(1H，dt，J=2.6，14.4 Hz，H-4b)，4.24(1H，m，H-3)，5.77(1H，brs，H-7)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：37.3(C-1)，48.0(C-2)，67.3(C-3)，46.6(C-4)，89.1(C-5)，174.5(C-6)，113.4(C-7)，185.8(C-8)，27.1(C-9)，31.1(C-10)，27.5(C-11).以上波谱特征与文献[10]报道基本一致，化合物4鉴定为黑麦草内酯(loliolide).

化合物5，白色固体，positive ESI-MS:m/z511[M+Na]+，分子式为C30H48O5.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：0.78(3H，s，H-24)，0.84(3H，d，J=6.9 Hz，H-29)，0.87(3H，d，J=6.9 Hz，H-30)，0.96(3H，s，H-26)，1.03(3H，s，H-25)，1.13(3H，s，H-27)，3.39，3.53(each 1H，d，J=11.0 Hz，H-23)，3.60(1H，d，J=2.3 Hz，H-3)，3.88(1H，ddd，J=2.3，4.2，11.8 Hz，H-2)，5.24(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：42.8(C-1)， 67.2(C-2)，78.6(C-3)，43.4(C-4)，44.1(C-5)，19.0(C-6)，33.9(C-7)，40.8(C-8)，48.8(C-9)，40.4(C-10)，24.2(C-11)，126.7(C-12)，139.8(C-13)，42.7(C-14)，29.2(C-15)，25.4(C-16)，48.7(C-17)，54.3(C-18)，40.4(C-19)，39.1(C-20)，31.9(C-21)，38.1(C-22)，71.3(C-23)，17.4(C-24)，17.7(C-25)，17.8(C-26)，24.5(C-27)，181.7(C-28)，17.6(C-29)，21.6(C-30).以上波谱特征与文献[13]报道基本一致，化合物5鉴定为2α,3α,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid).

图1 牛奶子枝叶中得到的化合物1～14的结构

化合物6，白色固体，positive ESI-MS:m/z551[M+Na]+，分子式为C33H52O5.1H NMR(500 MHz，C5D5N)δH：0.63(3H，s，H-24)，0.86(3H，s，H-26)，0.90(3H，d，J=6.2 Hz，H-30),0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-29)，0.96(3H，s，H-25)，1.13(3H，s，H-27)，1.42(3H，s，H-2′-CH3)，1.57(3H，s，H-3′-CH3)，3.45，3.74(each 1H，d，J=11.5 Hz，H-23)，3.99(1H，d，J=2.5 Hz，H-3)，4.15(1H，ddd，J=3.0，3.0， 11.0 Hz，H-2)，5.40(1H，t，J=2.7 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δC：42.1(C-1)，64.7(C-2)，76.9(C-3)，42.6(C-4)，42.3(C-5)，18.9(C-6)，32.9(C-7)，39.1(C-8)，47.7(C-9)，39.1(C-10)，23.6(C-11)，125.2(C-12)，139.0(C-13)，39.9(C-14)，28.3(C-15)，24.5(C-16)，47.4(C-17)，53.2(C-18)，38.0(C-19)，37.2(C-20)，30.7(C-21)，35.9(C-22)，68.0(C-23)，16.9(C-24)，17.3(C-25)，17.2(C-26)，23.4(C-27)，179.8(C-28)，16.7(C-29)，21.1(C-30)，98.3(C-1′)，29.6(C-2′)，17.6(C-3′).以上波谱特征与化合物5相比多了2个甲基(C-2′和C-3′)和一个季碳(C-1′)，为C-3位和C-23位的羟基与丙酮形成了缩酮[14]，化合物6鉴定为2α,3α,23-三羟基-3,23-异亚丙基二氧基乌苏-12-烯-28-酸(2α,3α,23-trihydroxy-3α,23-isopropyli denedioxyurs-12-en-28-oic acid).

化合物7，白色固体，negative ESI-MS:m/z471[M-H]-，分子式为C30H48O4.1H NMR(500 MHz，C5D5N)δH：0.93(3H，d，J=6.0 Hz，H-30)， 0.95(3H，s，H-26)，0.96(3H，d，J=6.0 Hz，H-29)，1.03(3H，s，H-25)，1.06(3H，s，H-24)，1.19(3H，s，H-27)，1.26(3H，s，H-23)，3.40(1H，d，J=9.3 Hz，H-3)，4.11(1H，ddd，J=4.4，6.8，13.8 Hz，H-2)，5.44(1H，t，J=3.5 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δC：47.6(C-1)，68.3(C-2)，83.6(C-3)，39.6(C-4)，55.7(C-5)，24.6(C-6)，33.2(C-7)，39.7(C-8)，47.7(C-9)，38.2(C-10)，30.8(C-11)，125.3(C-12)，139.0(C-13)，42.3(C-14)，28.4(C-15)，23.5(C-16)，47.8(C-17)，53.6(C-18)，39.2(C-19)，39.1(C-20)，18.6(C-21)，37.2(C-22)，17.5(C-23)，29.1(C-24)，17.3(C-25)，17.2(C-26)，23.6(C-27)，179.7(C-28)，21.2(C-29)，16.7(C-30).以上波谱特征与文献[14]报道基本一致，化合物7鉴定为2α-羟基熊果酸(2α-hydroxyursolic acid).

化合物8，白色固体，positive ESI-MS:m/z479[M+Na]+，分子式为C30H48O3.1H NMR(500 MHz，C5D5N)δH：0.87(3H，s，H-24)，0.94(3H，d，J=6.4 Hz，H-29)，0.99(3H，d，J=6.4 Hz，H-30)，1.02(3H，s，H-25)，1.09(3H，s，H-23)，1.22(3H，s，H-26)，1.23(3H，s，H-27)，3.45(1H，dd，J=5.8，9.9 Hz，H-3)，5.48(1H，t，J=3.4 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δC：39.1(C-1)，27.9(C-2)，77.8(C-3)，39.2(C-4)，55.5(C-5)，18.6(C-6)，33.3(C-7)，39.7(C-8)，47.8(C-9)，37.2(C-10)，17.4(C-11)，125.4(C-12)，139.0(C-13)，42.3(C-14)，28.4(C-15)，24.8(C-16)，47.8(C-17)，53.3(C-18)，38.8(C-19)，39.3(C-20)， 30.8(C-21)，37.0(C-22)，28.6(C-23)，16.4(C-24)，15.5(C-25)，17.2(C-26)，23.7(C-27)，179.7(C-28)，23.4(C-29)，21.2(C-30).以上波谱特征与文献[15] 报道基本一致，化合物8鉴定为熊果酸(ursolic acid).

化合物9，白色固体，negative ESI-MS:m/z455[M-H]-，分子式为C30H48O3.1H NMR(500 MHz，C5D5N)δH：0.84(3H，s，H-24)，1.01(3H，s，H-26)，1.05(3H，s，H-25)，1.06(3H，s，H-27)，1.23(3H，s，H-23)，1.79(3H，s，H-30)，3.46(1H，dd，J=6.0，9.3 Hz，H-3)，4.79(1H，d，J=2.0 Hz，H-29)，4.97(1H，d，J=2.0 Hz，H-29)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δC：40.6(C-1)，28.2(C-2)，77.4(C-3)，39.0(C-4)，56.1(C-5)，18.9(C-6)，37.0(C-7)，47.3(C-8)，50.4(C-9)，38.0(C-10)，25.6(C-11)，27.8(C-12)，38.7(C-13)，42.3(C-14)，32.3(C-15)，34.3(C-16)，55.4(C-17)，49.2(C-18)，49.1(C-19)，150.8(C-20)，30.6(C-21)，36.9(C-22)，29.7(C-23)，15.9(C-24)，15.8(C-25)，18.2(C-26)，14.4(C-27)，178.4(C-28)，109.5(C-29)，20.7(C-30).以上波谱特征与文献[15]报道基本一致，化合物9鉴定为白桦脂酸(betulinic acid).

化合物10，白色固体，positive ESI-MS:m/z219[M+Na]+，分子式为C10H12O4.1H NMR(500 MHz,CD3COCD3)δH：3.16(2H，s，H-8)，3.91(3H，s，OCH3)，3.92(2H，s，H-9),6.93(1H，d，J=7.9 Hz，H-5)，7.57(1H，s，H-2)，7.61(1H，d，J=7.9 Hz，H-6)，8.58(1H，s，OH)；13C NMR(125 MHz，CD3COCD3)δC：130.7(C-1)，111.5(C-2)，148.4(C-3)，152.4(C-4)，115.4(C-5)，124.0(C-6)，198.2(C-7)，41.5(C-8)，58.7(C-9)，56.3(OCH3).以上波谱特征与文献[16]报道基本一致，化合物10鉴定为3-羟基-1-(3-羟基-4-甲氧基苯)-1-丙酮.

化合物11，白色固体，positive ESI-MS:m/z381[M+Na]+，分子式为C20H22O6.1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δH：3.10(2H，brs，H-8，8′)，3.82(4H，m，H-9，9′)，3.85(6H，brs，2×OCH3)，4.69(2H，brs，H-7，7′)，6.83(4H，m，H-5，5′，6，6′)，7.01(2H，s，H-2，2′)；13C NMR(125 MHz，CD3COCD3)δC：134.1(C-1′，1′)，110.6(C-2′，2′)，148.3(C-3′，3′)，146.8(C-4′，4′)，115.6(C-5′，5′)，119.6(C-6′，6′)，86.6(C-7，7′)，55.2(C-8，8′)，72.2(C-9，9′)，56.2(2×OCH3).以上波谱特征与文献[17]报道基本一致，化合物11鉴定为pinoresinol.

化合物12，白色固体，positive ESI-MS:m/z441[M+Na]+，分子式为C22H26O8.1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δH：3.12(2H，m，H-8，8′)，3.83(12H，brs，4×OCH3)，3.86,4.24(each 2H，m，H-9，9′)，3.86(m) and 4.69(d，J=4.1 Hz)(each 2H，H-7，7′)，6.70(4H，s，H-2，2′，6，6′)；13C NMR(125 MHz，CD3COCD3)δC：133.1(C-1，1′)，104.3(C-2，2′，6，6′)，136.0(C-4，4′),148.6(C-3，3′，5，5′)，86.7(C-7，7′)，55.2(C-8，8′)，72.3(C-9，9′)，56.5(C-4×OCH3).以上波谱特征与文献[17]报道基本一致，化合物12鉴定为丁香脂素(syringaresinol).

化合物13，白色固体，positive ESI-MS:m/z383[M+Na]+，分子式为C20H24O6.1H NMR(500 MHz，CD3COCD3)δH：2.33(brs) and 2.54(t,J=11.8 Hz)(each 1H，H-7′)，2.92(m) and 2.71(brs)(each 1H，H-8,8′)，3.69(m) and 3.95(t,J=6.5 Hz)(each 1H，H-9′),3.69 and 3.86(each 1H，m,H-9)，4.80(1H，d，J=5.0 Hz，H-7)，3.83(6H，brs，2×OCH3)，6.67-6.96(6H,m,H-2,2′,5,5′,6,6′)；13C NMR(125 MHz，CD3COCD3) δC：133.3(C-1)，110.1(C-2)，148.2(C-3)，145.6(C-4)，115.6(C-5)，119.2(C-6)，33.5(C-7)，43.4(C-8)，73.0(C-9)，136.5(C-1′)，112.9(C-2′)，148.1(C-3′)，146.4(C-4′)，115.3(C-5′)，121.8(C-6′)，83.2(C-7′)，53.9(C-8′)，60.4(C-9′)，56.2(2×OCH3).以上波谱特征与文献[17]报道基本一致，化合物13鉴定为lariciresinol.

化合物14，黄色固体，positive ESI-MS:m/z471[M+Na]+，分子式为C21H20O11.1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH：5.28(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)，3.23-3.73(6H，m，H-2″，6″)，6.22(1H，s，H-6)，6.42(1H，s，H-8)，6.90(2H，d，J=7.5 Hz，H-3′，5′)，8.08(2H，d，J=7.5 Hz，H-2′，6′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δC：159.3(C-2)，135.5(C-3)，179.6(C-4)，163.2(C-5)，100.0(C-6)，166.1(C-7)，96.1(C-8)，158.6(C-9)，105.8(C-10)，122.9(C-1′)，132.4(C-2′，6′)，116.2(C-3′，5′)，161.7(C-4′)，104.1(C-1″)，73.8(C-2″)，76.1(C-3″)，71.4(C-4″)，77.5(C-5″)，62.7(C-6″).以上波谱特征与文献[18]报道基本一致，化合物14鉴定为紫云英苷(astragalin).

化合物15和16通过与标准品TLC对照， 三种不同展开剂展开，Rf值和10%硫酸乙醇溶液显色结果与标准品都相同，分别为β-谷甾醇和胡萝卜苷.

4 讨论

从牛奶子枝叶中得到16个化合物，类型涉及倍半萜、三萜、木脂素和黄酮等，与已有研究结果吻合，化合物1～13为首次从该植物中分离得到.所得化合物熊果酸(8)具有杀虫、消炎、防流感和抗糖尿病等功能[19]，白桦脂酸(9)具有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机体免疫力、调血脂和抗肿瘤等作用[19]，紫云英苷(14)具有抗癌、抗炎、抗氧化、神经保护、心脏保护、抗溃疡和抗纤维化等多种生物活性[20]，这些化合物的活性报道与该植物的药用记载可能有一定的关系.今后将在此研究基础之上，对牛奶子和其他胡颓子属植物进行化学成分和生物活性相结合的系统、深入的研究，为该植物或该属植物资源的合理利用奠定基础.