羊口疮与绵羊痘二联重组DNA疫苗的构建及其免疫应答

王 妍，文美龄，王仁铃，王蓬琨，关继羽，宋德光，陆慧君

(吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究所，吉林 长春 130062)

羊口疮是由羊口疮病毒(orf virus，ORFV)引起的一种高度接触性人兽共患传染病，主要感染山羊和绵羊，其病变部位多位于皮肤黏膜和口腔，会形成红斑、脓疱和结痂，羔羊致死率可达90%[1]，虽然该病对成年羊致死率低，但因继发感染和进食困难，会导致羊只消瘦，肉品质量下降，严重影响养羊业的发展。ORFV是痘病毒科(Poxviridae)，副痘病毒属(Parapoxvirus)代表性成员，具有独特的免疫逃逸特性，可以反复感染羊群，使得羊口疮成为传播最广的动物病毒性传染病之一。 ORFV是线性双股DNA病毒，长度为134～140 kb，编码约132个基因。其中ORFV的B2L基因大小为1 137 bp。研究表明，将B2L基因与流感疫苗共同免疫小鼠，可以显著提升流感疫苗对小鼠的免疫保护力，证明B2L蛋白是一种高免疫原性蛋白[2]。

绵羊痘是由绵羊痘病毒(sheep pox virus，SPPV)引起的一种急性、接触性传染病。SPPV在自然情况下仅感染绵羊，可在口腔、鼻腔、耳朵、乳房、尾巴腹侧等处会由最初的红斑发展成丘疹，最终形成隆起的球状结节。其发病率可达100%，成年羊致死率达50%，而羔羊的致死率可高达100%[3]。同时发现，临床上SPPV经常与ORFV发生混合感染[4]。SPPV 是一种大于200 nm线性双股DNA包膜病毒，长约150 kb，编码至少147个基因。其中SPPV的P32基因大小为972 bp，可编码P32蛋白，约为36 kDa。P32蛋白已用于开发ELISA试剂盒，以检测血清中的SPPV抗体，P32基因也是诊断试剂和疫苗的热门靶点[5]。

因此，开发一种既可同时预防上述2种疾病，又易于生产、运输和保存的二联疫苗具有重要的临床意义和应用价值。DNA疫苗属于基因工程疫苗，是通过分子克隆技术将病原中的免疫原性基因整合至表达载体。在真核启动子的作用下，在细胞内表达抗原，从而激发宿主的免疫应答，目前已有一些兽用基因工程疫苗得到了批号和量产[6]。DNA疫苗具有易于开发、批次之间稳定性好、无需冷链运输、可推广性强等优点。大量临床试验表明，DNA疫苗免疫效果和安全性较好[7]。

本研究基于ORFV的B2L基因与SPPV的P32基因，构建了二联重组DNA疫苗，并通过免疫小鼠对疫苗的免疫效果进行了评价。

1 材料与方法

1.1 毒株、质粒和细胞羊口疮病毒株、绵羊痘病毒株、E.coliDH5α感受态细胞、pcDNA3.1(+)真核表达载体、293T细胞以及原代胎羊鼻甲骨细胞(OFTu)由吉林大学动物医学学院病理实验室保存。

1.2 主要试剂PrimeSTAR Max DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker以及限制性内切酶购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA/PCR产物小量回收试剂盒和去内毒素质粒小提试剂盒购自天根生化科技公司；innuPREP Virus DNA Kit购自Analytik Jena公司；同源重组酶购自全式金生物技术有限责任公司；DMEM细胞培养液购自美仑生物技术公司；胎牛血清购自Biological Industries生物科技公司；LipoFiter脂质体转染试剂购自汉恒生物技术有限公司；IL-4和IFN-γ ELISA检测试剂盒购自Biolegend公司；抗Myc标签单克隆抗体、抗Flag标签单克隆抗体及抗HRP标记羊抗鼠IgG购自Proteintech公司。

1.3 ORFV和SPPV全基因组DNA提取取适量实验室预先保存的病毒液，按照innuPREP Virus DNA Kit说明书进行全基因组DNA的提取。

1.4 引物的设计与合成参考GenBank：MG712417.1中的B2L基因序列与GenBank：AY077834.1中的P32基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列如表1所示，引物均由长春库美生物公司合成。

1.5 重组质粒的构建

1.5.1融合基因片段的扩增与纯化 首先以ORFV的B2L基因区域为模板，引物F1与R1为上、下游引物，扩增出1 227 bp的Flag-B2L-P2A片段；以SPPV 的P32基因区域为模板，引物F2与R2为上、下游引物，扩增1 059 bp的P2A-P32-Myc片段。反应条件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 10 s，35个循环；72℃ 10 min。以Flag-B2L-P2A片段和P2A-P32-Myc片段为模板，引物F1和R2为上、下游引物，进行重叠延伸PCR，扩增2 263 bp的Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段。反应条件：98℃ 2 min;98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，35个循环；72℃ 10 min。以Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段为模板，引物F3与R3，扩增出2 209 bp的B2L-P2A-P32片段。反应条件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，35个循环；72℃ 10 min。上述所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，纯化回收。

1.5.2连接和转化反应 pcDNA3.1(+)质粒用限制性内切酶BamHⅠ、ApaⅠ及BamHⅠ、HindⅢ分别于37℃水浴作用2 h，对载体进行线性化处理，酶切产物经凝胶电泳鉴定后回收；将回收的线性化载体与扩增出来的Flag-B2L-P2A-P32-Myc和B2L-P2A-P32基因进行同源重组；随后将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂到氨苄固体培养基，37℃过夜培养。

表1 PCR引物信息

1.5.3阳性克隆检测 挑取单个菌落做菌液PCR鉴定，PCR阳性菌液扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定。重组质粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc用限制性内切酶BamHⅠ和ApaⅠ进行消化，pcDNA3.1-B2L-P2A-P32用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行消化，37℃水浴2 h；1%琼脂糖凝胶电泳，观察、保存酶切鉴定结果。将鉴定正确的菌液送至吉林生工生物公司测序,测序成功后的菌液于-80℃保存备用。

1.6 重组质粒的表达

1.6.1转染293T细胞 293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，于37℃、5% CO2中进行培养。转染前1 d将293T细胞铺至6孔板内，使第2天细胞汇合度达到70%～80%；将pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc重组质粒转染293T细胞，培养箱内继续培养48 h；每孔加入160 μL RIPA裂解液、1.6 μL蛋白酶抑制剂PMSF(100×)，冰上裂解30 min；最后加入SDS-PAGE上样缓冲液(5×)，煮沸样品10 min。

1.6.2Western blot检测目的蛋白的表达 使用PAGE凝胶快速制备试剂盒(12.5%)配制蛋白胶；取20 μL样品进行电泳，将蛋白转移到PVDF膜上；5%脱脂奶粉37℃封闭30 min；使用Flag标签抗体、Myc标签抗体、β-actin内参抗体和GAPDH内参抗体，4℃孵育过夜；TBS-T缓冲液洗膜，使用对应源性HRP标记的二抗，37℃孵育1 h；TBS-T缓冲液洗膜，使用超敏ECL发光液显色，利用Image J软件对蛋白进行定量分析。

1.7 DNA疫苗免疫小鼠效果评价

1.7.1免疫程序 42只6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，每组6只，具体分组情况：3个对照组(PBS组、pcDNA3.1(+)质粒和pcDNA3.1(+)质粒+佐剂组)和4个疫苗免疫组(pcDNA3.1-B2L-P2A-P32重组质粒组、pcDNA3.1-B2L-P2A-P32重组质粒+佐剂组、iORFV+佐剂组和iSPPV+佐剂组)。

首免的佐剂为完全弗氏佐剂，加强免疫的佐剂为不完全弗氏佐剂；病毒液与β-丙内酯1∶3 000充分混合，4℃静置24 h灭活，37℃水浴水解2 h后再与佐剂混合；质粒的免疫剂量为100 μg/100 μL，灭活病毒的免疫剂量为1×105TCID50/100 μL；疫苗与佐剂1∶1混合，0，21 d在小鼠大腿外侧肌肉注射，取首免后第1，3，5周的小鼠血清。

1.7.2血清特异性抗体检测 采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体。用碳酸盐缓冲液分别稀释ORFV病毒液(106TCID50/0.1 mL)与SPPV病毒液(106TCID50/0.1 mL)，每孔取100 μL加入ELISA板内，4℃包被12 h；洗板时每孔加200 μL PBST，微孔板混匀仪振荡1 min，弃去洗板液，重复洗板2次，每孔加入100 μL 5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h；洗板4次，每孔加入100 μL稀释的血清，以1∶50稀释血清，37℃孵育1 h；洗板4次，每孔加入100 μL HRP标记的鼠源二抗(以1∶10 000稀释)，37℃封闭1 h；洗板4次，每孔加入100 μL新鲜配置的显色液，避光孵育15 min;每孔加入100 μL的终止液,在450 nm波长处测定D值。

1.7.3中和抗体的检测 试验前1 d将OFTu细胞铺至96孔板，确保第2天细胞的汇合度可以达到70%～80%；将血清在56℃水浴灭活30 min，随后以1∶10进行倍比稀释，并加入病毒液10 μL(106TCID50/0.1 mL)，每孔共加入100 μL溶液；将血清与病毒溶液充分混合，置于培养箱内培养1 h；培养细胞的96孔板弃去原液，用无菌的PBS溶液洗1次，加入血清-病毒混合液，在培养箱内孵育1 h；弃去原液，每孔加200 μL 2% DMEM培养液继续培养；在3～5 d内观察细胞状态，记录出现病毒病变的孔数，根据Karber法计算中和抗体效价。

1.7.4细胞因子的检测 血清中IL-4和IFN-γ的检测均按照Biolegend公司ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IL-4和IFN-γ试剂盒说明书操作进行，每个血清样品重复3次。

1.7.5小鼠攻毒保护性试验 在首次免疫后的第35天，进行攻毒保护性试验，其中每组取6只小鼠接毒SPPV，攻毒剂量均为107TCID50/只，接毒方式为尾静脉注射。攻毒后第14天，分离小鼠肺脏，提取肺脏组织RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR法来测定肺脏中的病毒载量， SPPV基因区域的序列参考GenBank：AY077834.1。设计的引物如表2所示，由长春库美生物有限公司合成。

表2 实时荧光定量PCR引物信息

2 结果

2.1 ORFVB2L基因、SPPVP32基因以及融合基因PCR扩增所有经PCR扩增的基因片段均用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。Flag-B2L-P2A片段如图1A所示，PCR扩增获得大小为1 227 bp的目的条带；P2A-P32-Myc片段如图1B所示，PCR扩增获得大小为1 059 bp的目的条带；Flag-B2L-P2A-P32-Myc融合片段如图1C所示，在2 263 bp处得到目的条带；B2L-P2A-P32融合片段的PCR扩增结果如图1D所示，在2 209 bp处得到目的条带。所有条带大小均与预期结果相符。

A.ORFV B2L基因PCR扩增结果(M.DL2000 DNA Marker；1.Flag-B2L-P2A片段PCR扩增结果；2.阴性对照)；B.SPPV P32基因PCR扩增结果(M.DL2000 DNA Marker；1.P2A-P32-Myc片段PCR扩增结果；2.阴性对照)；C.带标签的融合基因PCR扩增结果(M.DL2000 DNA Marker；1.Flag-B2L-P2A-P32-Myc片段PCR扩增结果；2.阴性对照)；D.融合基因PCR扩增结果(M.DL2000 DNA Marker；1.B2L-P2A-P32片段PCR扩增结果；2.阴性对照)

2.2 重组表达质粒的酶切验证结果酶切产物均用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。重组质粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc双酶切验证后可见5 356 bp的大片段和2 235 bp的小片段(图2A)；重组质粒pcDNA3.1-B2L-P2A-P32双酶切验证后可见5 410 bp的大片段和2 181 bp的小片段(图2B)。所有条带大小均与预期结果相符，结果显示重组质粒构建成功。

A.重组质粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc的鉴定结果(M.DL15000 DNA Marker；1.BamHⅠ和ApaⅠ双酶切；2.未酶切；3.BamHⅠ单酶切；4.ApaⅠ单酶切)；B.重组质粒pcDNA3.1-B2L-P2A-P32的鉴定结果(M.DL15000 DNA Marker；1.HindⅢ和BamHⅠ双酶切；2.未酶切；3.HindⅢ单酶切；4.BamHⅠ单酶切)

2.3 重组质粒转染真核细胞后的蛋白表达、切割鉴定结果将重组质粒转染293T细胞72 h后，收取蛋白样品，经Western blot分析，用抗Flag标签抗体检测Flag-B2L-P2A多肽片段及未切割的多肽片段，结果如图3A所示，43 kDa处为切割后的Flag-B2L-P2A多肽；用抗Myc标签抗体检测P32-Myc多肽片段及未切割的多肽片段，结果如图3B所示，37 kDa处为切割后的P2A-P32-Myc多肽，未切割的蛋白均在81 kDa处，特异性蛋白条带与实际预测蛋白的大小一致。pcDNA3.1(+)质粒及293T细胞未检测到特异性条带。结果表明，该重组质粒的自剪切肽P2A在真核细胞内发生了自剪切，ORFVB2L基因编码的蛋白与SPPVP32基因编码的蛋白在真核细胞内可以独立表达。

A.抗Flag标签抗体检测结果(M.蛋白Marker；1.正常293T细胞；2.重组质粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc转染的293T细胞；3.质粒pcDNA3.1(+)转染的293T细胞)；B.抗Myc标签抗体检测结果(M.蛋白Marker；1.正常293T细胞；2.重组质粒pcDNA3.1-Flag-B2L-P2A-P32-Myc转染的293T细胞；3.质粒pcDNA3.1(+)转染的293T细胞)

2.4 血清中特异性抗体水平检测自制间接ELISA法，分别使用ORFV(106TCID50/0.1 mL)和SPPV(106TCID50/0.1 mL)作为抗原包被酶标板，对免疫后1，3，5周采集的血清进行检测，结果如图4所示，4个疫苗组均检测到了特异性抗体，在加强免疫后抗体水平再次升高，而3个对照组均未检测到特异性抗体。在第5周，重组质粒+佐剂组对2种病毒的特异性抗体水平均高于重组质粒组，说明重组质粒与佐剂混合后免疫，是有助于重组质粒在体内的缓慢释放而激发更高的免疫效果，重组质粒+佐剂组与3个对照组相比，统计学差异极显著(P<0.001)，重组DNA疫苗+佐剂组与2个灭活疫苗组相比，特异性抗体水平相当，统计学无显著性差异(P>0.05)。

以上结果证明该重组DNA疫苗可以激发小鼠产生抗ORFV(图4A)和SPPV(图4B)的特异性抗体。在加强免疫后，重组质粒的免疫水平再次升高，证明该疫苗可激活小鼠的体液免疫。

A.血清中ORFV特异性抗体水平；B.血清中SPPV特异性抗体水平。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。下同

2.5 血清中的中和抗体效价检测取免疫后第5周的血清进行中和抗体效价检测，结果如图5所示，除3个对照组外，重组质粒组、重组质粒+佐剂组和iSPPV+佐剂组对SPPV均产生了中和抗体，半数中和单位分别为10-1.9，10-1.85和10-1.725。重组质粒+佐剂组和重组质粒组在统计学上无显著性差异(P>0.05)，与iSPPV+佐剂对照组相比，抗体水平相当，统计学亦无显著性差异(P>0.05)，重组质粒+佐剂组与对照组差异显著(P<0.05)。说明该重组质粒+佐剂组可以诱导小鼠产生抗SPPV的中和抗体。

重组DNA疫苗组、重组质粒+佐剂组和iORFV+佐剂组未能检测到中和ORFV的抗体。据报道，ORFV因独特的免疫逃避机制，虽然免疫相关疫苗后，会产生较高的免疫指标，无法生成中和抗体。

2.6 血清中细胞因子水平检测采用ELISA试剂盒对免疫后1，3，5周血清中的细胞因子进行检测，IL-4和IFN-γ的水平如图6所示。在免疫后3，5周，重组质粒组、重组质粒+佐剂组、iORFV+佐剂组和iSPPV+佐剂组分泌的IL-4和IFN-γ水平随着加强免疫而增高，其余对照组均未见升高趋势。

如图6A所示，重组质粒+佐剂组在第3周为56.89 ng/L，第5周比第3周高0.57倍。在第5周，重组质粒+佐剂组比iORFV+佐剂组高0.21倍，统计学差异极显著(P<0.001)，比iSPPV+佐剂组高0.09倍，统计学无显著性差异(P>0.05)。同时发现，重组质粒+佐剂组与其他对照组相比，统计学差异极显著(P<0.001)。

图5 血清中的中和抗体效价

如图6B所示，重组质粒+佐剂组分泌的IFN-γ水平最高，第5周为355.15 ng/L，比第3周高0.72倍。在第5周，重组质粒+佐剂组的IFN-γ水平比iORFV+佐剂组高0.19倍，统计学差异显著(P<0.05)，比iSPPV+佐剂组高0.27倍，统计学差异极显著(P<0.01)。同时发现，重组质粒+佐剂组与其他对照组相比，统计学差异极显著(P<0.001)。

Th2型细胞分泌IL-4，主要参与体液免疫，Th1型细胞分泌IFN-γ，主要参与细胞免疫。加强免疫后，重组DNA疫苗+佐剂组的IL-4与IFN-γ的水平均为最高。结果表明，重组DNA疫苗可同时诱导Th1及Th2型免疫。

A.血清中IL-4水平检测；B.血清中IFN-γ水平检测

2.7 小鼠攻毒后病毒载量水平检测对加强免疫后14 d的小鼠进行攻毒试验，尾静脉接毒107TCID50/只，攻毒结束后提取小鼠肺脏组织RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，以检测各组的病毒载量水平。

攻毒SPPV的检测结果如图7所示，重组疫苗+佐剂组、灭活疫苗组和健康对照组小鼠的病毒载量水平相当，统计学上无显著性差异(P>0.05)，重组疫苗+佐剂组低于3个对照组，统计学上差异显著(P<0.01)。重组质粒组的小鼠病毒载量远低于对照组，与灭活疫苗组的病毒载量无显著性差异，证明该重组DNA疫苗可以起到对小鼠的保护作用。

图7 小鼠攻毒SPPV后肺脏的病毒载量变化

3 讨论

羊口疮和绵羊痘在全世界养羊业发达的地区呈广泛流行，受感染的羊群临床上常呈现混合感染，给养殖业带来巨大的经济损失。有研究表明，对单独ORFV的免疫原性基因B2L和单独SPPV的P32免疫原性基因制备的基因工程疫苗进行研究，发现2种疫苗均具有较好的免疫效果[8-9]。鉴于2种病毒常混合感染羊群，研发安全、高效的二联苗势在必行。因此，本研究将上述2个病原的免疫原性基因串联，构建了抗羊口疮和绵羊痘二联重组DNA疫苗，并在试验动物小鼠体内进行了免疫效果评价，发现二联DNA疫苗具有较好的免疫效果。

近年来，国内学者对2种病毒免疫原性基因及相应表达产物的免疫学研究较多。李杰等[10]将ORFVB2L基因进行扩增，构建到pET-32a原核表达载体中，进行蛋白诱导表达、纯化，并免疫家兔，制备出多克隆抗体。经过ELISA以及Western blot验证，B2L蛋白具有能与兔抗ORFV抗血清反应的能力，证明了B2L蛋白与ORFV拥有共同的B细胞表位。有研究人员也构建了基于ORFVB2L基因的真核表达质粒，免疫小鼠后发现，小鼠可以产生针对ORFV的特异性抗体，可以诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫[11]。丁军涛等[12]以减毒鼠沙门菌X4550为载体，构建了SPPVP32胞外段基因的新型口服活载体DNA疫苗，结果显示活载体疫苗具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生持久的、高水平的免疫应答。田静等[13]通过GPI锚定策略将P32蛋白锚定到新城疫病毒样颗粒囊膜表面制备成嵌合型病毒样颗粒cVLP-P32，通过对小鼠和羊的免疫试验证明，cVLP-P32能诱导小鼠及羊产生特异性抗体，也可以诱导小鼠产生CD3+CD4+T以及CD4+CD8+T细胞免疫应答。

目前，国内有关绵羊痘和羊口疮二联疫苗生产尚属空白，国外临床生产中所用二联疫苗多为弱毒疫苗，虽然产生了一定的免疫效果，但是该疫苗在免疫过程中存在病毒扩散、毒力反强的危险[14]。因此，研发一种安全有效的二联疫苗显得极其重要。与传统疫苗相比，DNA疫苗设计简洁、制造成本较低、研制周期较短、且易于储存，减少了运输过程中对冷链的需求，而且使用 DNA 质粒进行疫苗接种消除了从感染性病原体中纯化蛋白质的必要性，从而提高了安全性[15]。

为此，本研究通过构建一种ORFVB2L基因与SPPVP32基因的二联重组DNA疫苗，并证明该疫苗能在真核细胞中独立表达免疫原性多肽。免疫后可诱导宿主产生抗羊口疮和绵羊痘的特异性抗体，也可以产生抗绵羊痘的中和抗体，同时也提示成功激发了宿主的细胞免疫；不仅如此，疫苗也可以对SPPV攻毒后的小鼠起到一定的保护作用。上述研究结果为开展羊口疮和绵羊痘的联合预防研究奠定了基础，具有重要的实践意义与潜在应用价值。