肿瘤抑制因子microRNA-218对前列腺癌细胞恶性进展及肿瘤干细胞特性的调控作用

穆丽君，管 冰，田娟华，杜岳峰，李旭东

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是发达国家男性最常见的癌症，2008年约有64.84万例新发病例和13.65万例死亡病例[1]。目前，雄激素剥夺疗法是转移性PCa的主要治疗方法，然而许多患者却出现了去势抵抗PCa，使得治疗效果不甚理想，这也是发达国家男性病例死亡的主要原因[2]。因此，我们迫切需要进一步的研究来开发更有效的治疗方法。

microRNA(miRNA)是一类非编码单链RNA，通过结合靶基因mRNA的3’-UTR来调节肿瘤相关基因的表达[3-5]。已有研究报道，miRNAs(miR)在人类癌症生物学过程中发挥着重要作用，包括肿瘤的发生、发展、迁移和转移[6-8]。就PCa的进展而言，miR-34a可通过直接抑制CD44[9]从而抑制PCa干细胞(cancer stem cell，CSC)特性和癌细胞转移；miR-132/212可通过靶向SOX4抑制TGF-β介导的PCa细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[10]。肿瘤抑制性miR-29可靶向PCa中的LAMC1抑制癌细胞迁移和侵袭[11]。我们先前的研究也报道了miR-218在PCa中起到肿瘤抑制的作用，但miR-218在调节PCa干细胞和EMT中的作用仍不明确。为此，本研究就miR-218在PCa细胞系中的表达及在体外实验中对PCa细胞系迁移、EMT和肿瘤干细胞特性的影响作一探索并报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系与细胞培养PCa细胞系LNCaP和C4-2购买自美国典型培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，前列腺-上皮细胞(BPH-1)细胞由美国德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心Jer-Tsong Hsieh博士提供。这3种细胞均培养于添加了10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Hyclone， GE Healthcare Life Sciences)的RPMI-1640培养基中(Gibco，Thermo Fisher Scientific)，培养条件为37 ℃，5%(体积分数)CO2。

1.2 总RNA提取和qPCR分析依据试剂使用说明，应用Trizol(Thermo Fisher Scientific)从收获的细胞中提取总RNA，并使用miSccript Ⅱ RT试剂盒(Qiagen，GmbH，Hilden)将总RNA反转录为cDNA。CFX96 PCR系统(Bio-Rad Laboratories)和SYBR-Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio)用于检测miR-218的转录表达。PCR反应程序如下：95 ℃下30 s，然后在95 ℃下40次循环每次5 s，最后在60 ℃下30 s。使用U6作为内参，并使用2-ΔΔCq方法计算相对基因表达[12]。使用的引物序列如下：miR-218正向引物5’-CGA GTG CAT TTG TGC TTG ATC TA-3’，反向引物5’-TAA TGG TCG AAC GCC TAA CGT C-3’；U6正向引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，反向引物5’-TGG TGT CGT GGA GTC G-3’。

1.3 慢病毒转染LNCaP和C4-2细胞接种培养皿并培养24 h，在细胞融合度达到40%～50%时进行慢病毒转染。委托上海吉玛制药技术有限公司构建慢病毒载体3(LV3-miR-218)，和LV3加扰慢病毒载体(LV3-NC)作为阴性对照，用于隔夜培养转染细胞。慢病毒感染细胞后48 h，通过嘌呤霉素(2～3 μg/mL)(Sigma-Aldrich)抗性培养维持miR-218过表达组和对照组的稳定克隆。

1.4 Transwell迁移试验在24孔板内加入1 mL含10%FBS的RPMI-1640培养基作为趋化剂。将孔径为8 μm的Transwell小室(Millipore)放入24孔板中，再将悬浮在无血清培养基中的细胞以(5～8)×104个细胞/mL的密度接种到小室上层，接种体积为400 μL/孔。培养20 h后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，接着用棉签轻擦除上室表面未穿出的细胞，然后将小室在室温下用0.1%结晶紫染色20 min，最后用PBS清洗干净。在显微镜下观察，放大200倍，每孔随机选6个视野进行计数。

1.5 蛋白印迹实验用提前在4 ℃预冷的PBS涮洗细胞，然后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白，接着通过Bradford法进行蛋白质浓度定量(Abcam)。每份样品取30 μg蛋白质所需的体积，通过12%SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜中。转膜完成后，将膜在室温下于50 g/L脱脂牛奶中封闭1 h，然后将膜孵育在一抗中，4 ℃过夜。应用一抗浓度及对应货号如下：GAPDH (1∶10 000;货号KC-5G4; 康成生物); E-cadherin (1∶1 000; 货号sc-8426; Santa Cruz); Vimentin (1∶200; 货号sc-6260; Santa Cruz); CD44 (1∶800; 货号 3 570; Cell Signaling Technology); Oct4 (1∶500; 货号 ab18976; Abcam); Nanog (1∶200;货号 ab21624; Abcam)。接着将膜在含有0.1%吐温(Tween)的三缓冲盐水(tris-buffered saline)中缓慢洗涤3次，并与辣根过氧化物酶结合的二抗山羊抗兔IgG(1∶2 000；货号ZB-2301，傲锐东源)或山羊抗鼠IgG(1∶2 000；货号ZB-2305，傲锐东源)在室温下孵育1 h。最后使用分子成像仪ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad Laboratories)对蛋白质条带进行成像。

1.6 平板克隆形成实验6孔板中每孔接种约2×103个细胞，孵育10～14 d。用PBS涮洗3次，接着用40 g/L多聚甲醛在室温固定30 min，再用0.1%结晶紫染色20 min，用PBS清洗干净后，对每孔的细胞克隆进行计数。

1.7 肿瘤成球实验在低粘附性6孔板中每孔接种约1×104个细胞，添加无血清F12培养基，及20 ng/mL表皮生长因子，10 ng/mL基础成纤维细胞生长因子以及2% B27(皆来自Invitrogen; Thermo Fisher Scient)。培养2周后，使用倒置显微镜放大200倍观察细胞成球情况。

1.8 统计学方法所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0版本进行。两组之间的差异采用t检验比较；3组及以上的比较，采用单因素方差分析和Tukey法检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-218在PCa细胞中表达下调应用RT-qPCR比较PCa细胞和人正常前列腺上皮细胞(BPH-1)miR-218的表达。结果显示，与人正常BPH-1相比，PCa细胞系LNCaP和C4-2中miR-218的表达显著下调(U6作为内参)。

2.2 构建稳定的过表达miR-218的PCa细胞系为了揭示miR-218对PCa细胞迁移、EMT以及CSC特性的影响，我们通过搭载LV3-miR-218的慢病毒载体转染PCa细胞系LNCaP和C4-2，构建了2种稳定过表达miR-218的PCa细胞系，接着RT-qPCR检验过表达效率。

2.3 过表达miR-218可抑制PCa细胞迁移和EMTTranswell迁移实验结果表明，miR-218过表达抑制了LNCaP和C4-2细胞的迁移(图1)。同时EMT标记物的Western blot结果显示，miR-218过表达导致E-钙黏蛋白(E-Cadherin)表达轻微增加，波形蛋白(vimentin)表达显著降低。以上结果说明，miR-218的过度表达可抑制PCa细胞的迁移和EMT。

A：miR-218过表达抑制了LNCaP细胞的迁移；B：在C4-2细胞中也观察到类似的结果。以上数据代表3个独立实验(×200)。与LV3-NC相比，*P<0.05。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒载体3；NC，阴性对照。

2.4 过表达miR-218可抑制PCa细胞CSC特性在验证miR-218过表达可抑制PCa细胞迁移和EMT之后，我们通过Western blot实验对癌症干细胞标记物进行蛋白质表达谱分析。结果表明，miR-218的过表达能够下调CD44、Oct4和Nanog的表达。此外，我们进行平板克隆形成实验以进一步评估PCa细胞的自我更新能力。结果表明，与对照组细胞相比，过表达miR-218的LNCaP细胞形成的细胞克隆更少、更小(图2A)。在C4-2细胞中进行的平板克隆形成实验也获得了类似的结果(图2B)，这表明miR-218可能在肿瘤生长抑制中起关键作用。肿瘤成球试验已被广泛应用于测量干细胞的自我更新能力，表明miR-218的过表达可降低PCa细胞的干细胞特性。

A：在集落形成试验中，与对照组LV3-NC细胞相比，LNCaP-LV3-miR-218细胞形成的集落更少、更小；B：C4-2-LV3-miR-218细胞较LV3-NC细胞相比，形成的细胞集落更少且更小。miR-218：microRNA-218；LV3：慢病毒载体3；NC:阴性对照。

3 讨 论

近年来，PCa的诊断和治疗虽取得了一定的进展[13]，但有关PCa的研究仍具挑战。据文献报道，EMT和CSC对癌症的发生和发展至关重要[14-18]，且先前研究表明，miRNA在人类癌症生物学过程中也起着重要作用，包括发生、发展、迁移和转移[19-23]。miR-218作为肿瘤抑制因子，在多种类型的人类癌症中表达下调[24-28]。miR-218可抑制胶质瘤、宫颈癌、胃癌和膀胱癌等肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、EMT、淋巴结转移和自我更新[29-33]。有研究阐明，PCa中miR-218的表达降低，而其可通过抑制富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 4，LGR4)表达阻止白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)诱导的PCa细胞增殖和侵袭[34]。miR-218还被证明通过抑制TPD52表达进而抑制PCa细胞生长和促进凋亡[35]，并通过靶向LASP1抑制PCa细胞迁移和侵袭[36]。因此，我们推测miR-218也可能抑制PCa细胞的EMT和CSC特性。

在本研究中，miR-218在PCa细胞中的表达显著下调，构建过表达miR-218的LNCaP/C4-2细胞可显著抑制PCa细胞的迁移。Western blot结果显示，miR-218的过表达下调了波形蛋白、CD44、Oct4和Nanog的表达。在集落形成试验中，miR-218过表达细胞所形成的集落比对照组要少且小。此外，与miR-218过表达组的细胞相比，对照组细胞产生的肿瘤球数量更多，这表明miR-218过度表达可抑制PCa的干细胞特性。

总之，本研究表明miR-218在抑制PCa细胞的迁移、EMT和CSC特性方面起着关键作用。这为阐明PCa癌变的潜在机制提供了新的见解，并表明miR-218可能是PCa的潜在治疗靶点。