外泌体lncRNAs在结直肠癌中西医研究中的现状及思考

荣汶青,柴妮,朱惠蓉

(1.上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203;2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437)

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大癌症,死亡率高居第二[1]。结直肠癌的发生发展机制十分复杂,近年研究显示,外泌体长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNAs)在这一过程中扮演重要角色。lncRNAs是由超过200个核苷酸组成的非编码RNA,它们通过与DNA、RNA和蛋白质相互作用调节基因表达,并在可变剪接机制、蛋白质定位和活性、细胞亚结构和蛋白质复合物的形成等方面发挥重要作用[2]。外泌体是小的细胞外囊泡,来源于几乎所有类型的人类细胞,通过体液循环和细胞受体进入靶细胞,在多种人类疾病中起着关键作用,尤其是癌症。多项研究[3-7]表明,lncRNAs可以被外泌体包裹,转移到受体细胞,进一步影响结直肠癌进展和转移,并可作为诊断及判断预后的循环标志物。同时,外泌体lncRNAs也可以通过调控肿瘤微环境多种关键信号通路和蛋白表达,进而影响结直肠癌的发生发展。

古今医家对结直肠癌治疗的认识不尽相同,但总体认为其基本病机为本虚标实,本虚为正气亏虚,标实为痰、湿、热、毒、瘀等病理因素交互为患,正虚导致病理因素产生,病理因素加重正虚,导致结直肠癌缠绵难愈,迅速进展。外泌体lncRNAs通过多种途径影响结直肠癌的发生发展,与中医学对其“正虚邪实”病机的认识高度契合,本文试从外泌体lncRNAs在结直肠癌发生发展中的作用机制阐释结直肠癌正虚邪实病机,并探讨中医药通过干预外泌体lncRNAs发挥作用的可能机制。

1 外泌体lncRNAs影响结直肠癌发生发展

外泌体lncRNAs通过影响多种结直肠癌发生发展的关键事件,如免疫逃逸、上皮间充质转化(EMT)、血管生成、化疗抗性等,促进结直肠癌进程。

1.1 诱导免疫逃逸

免疫系统监视是肿瘤发生发展过程中的关键环节,脱离机体免疫的监控后,肿瘤的恶性生物学行为显著加快,促使肿瘤增殖、侵袭和转移。Huang等[8]研究显示,结直肠癌细胞来源的外泌体lncRNA SNHG10通过上调INHBC的表达抑制NK细胞的功能从而促进免疫逃逸。Xian等[9]发现lncRNA KCNQ1OT1在结直肠癌来源的外泌体中的表达显著增加,KCNQ1OT1可通过miR-30a-5p/USP22调节PD-L1泛素化,促进结直肠癌免疫逃逸。Sun等[10]研究发现结直肠癌细胞外泌体lncRNA CRNDE-h显著升高并将它们传递给CD4+T细胞以增加Th17细胞比例、RORγt表达和IL-17启动子活性,减弱宿主免疫监视功能,促进肿瘤免疫逃逸。Liang等[11]发现lncRNA RPPH1在结直肠癌组织中显著上调,结直肠癌细胞来源的外泌体可将RPPH1转运至巨噬细胞,介导巨噬细胞M2极化,诱导免疫逃逸,促进结直肠癌细胞的转移和增殖。

1.2 促进增殖

肿瘤细胞因失去接触抑制导致迅速增殖,是肿瘤发生发展过程中最常见的恶性表型。Xu等[12]证实结直肠癌细外泌体MALAT1通过调节FUT4并激活PI3K/Akt/mTOR通路,通过海绵miR-26a/26b促进结直肠癌细胞的增殖。Luan等[13]发现结直肠癌患者血清外泌体lncRNA UCA1上调,外泌体可以将UCA1转移到结直肠癌细胞以增加其增殖。Liu等[14]研究发现结直肠癌患者外泌体LncRNA GAS5表达降低,通过与miR-221作用促进细胞增殖。Li等[15]发现lncRNA ADAMTS9-AS1在结直肠癌组织中显著减少,其在体外和体内调节细胞增殖。Yin等[16]发现lncRNA NNT-AS1在结直肠癌外泌体中上调,NNT-AS1的沉默抑制了结直肠癌细胞的增殖。

1.3 增加化疗及靶向治疗抗性

化疗及靶向治疗耐药是结直肠癌治疗失败的主要原因,多项研究发现外泌体lncRNAs在结直肠癌细胞耐药中发挥重要作用。Chen等[17]在丝裂霉素抗性的结直肠癌细胞中检测到lncRNA HOTTIP的高表达,并发现HOTTIP通过丝裂霉素抗性细胞分泌的外泌体转移到亲代细胞中,提高丝裂霉素抗性。Sun等[18]筛选与结直肠癌耐药相关表达的外泌体lncRNA,发现CRNDE、H19、UCA1和HOTAIR显著升高,其中HOTAIR的过表达同时与晚期结直肠癌肿瘤淋巴结转移及预后不良相关。Deng等[19]研究显示,lncRNA CCAL促进结直肠癌细胞的奥沙利铂抗性,CCAL通过外泌体激活肿瘤相关成纤维细胞,抑制结直肠癌细胞凋亡,诱导化学抗性并激活β-连环蛋白信号通路。Ren等[20]发现结直肠癌患者肿瘤相关成纤维细胞衍生的外泌体富含lncRNA H19,可促进结直肠癌细胞的化学抗性。在晚期结直肠癌的治疗中,靶向联合化疗已成为一线方案,其中西妥昔单抗为临床常用的靶向药物之一。Yang等[21]发现外泌体lncRNA UCA1在西妥昔单抗耐药的癌细胞及其外泌体中表达显著升高,来自西妥昔单抗耐药细胞的外泌体可以显著提高UCA1表达,并将耐药性传递给敏感细胞。

1.4 促进血管新生

血管新生指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管过程,与结直肠癌细胞增殖、转移等密切相关,已成为结直肠癌治疗的重要靶标,该过程涉及多种细胞因子。研究发现外泌体lncRNAs在结直肠癌血管新生中发挥重要作用。Wang等[22]发现lncRNA-APC1表达降低与淋巴结和/或远处转移、更晚期的临床分期以及结直肠癌患者的不良预后呈正相关,增强lncRNA-APC1表达可抑制结直肠癌细胞的生长、转移和肿瘤血管生成。

1.5 驱动上皮间充质转化

上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是细胞失去其上皮特征,并获得间充质特性的过程[23]。EMT在结直肠癌进展、转移和耐药性中起重要作用[24]。来自临床前和早期临床研究的越来越多的证据表明,EMT标志物可能作为结直肠癌的结果预测因子和潜在的治疗靶点。Zhou等[25]发现肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)衍生的外泌体中LINC00659的表达显著增加,CAFs-exo可显著促进结直肠癌细胞EMT,促进大肠癌进展。

2 外泌体lncRNA在结直肠癌诊断及预后中的临床意义

目前临床常用的结直肠癌诊断标志物主要为癌胚抗原(CEA)、CA-199、CA125等,但它们对结直肠癌诊断的特异性和敏感性都不高。外泌体lncRNAs因其片段稳定、表达特异性高、广泛存在于血液中等优势,是一种在结直肠癌的诊断与预后预测中具有较强潜力的生物标志物。Yu等[4]通过比较结直肠癌患者及健康志愿者血清样本,发现结直肠癌患者的外泌体FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459(TCONS_00020073)水平显著上调,联合检测对于结直肠癌诊断的ROC曲线下面积(AUC)为0.736。Zhao等[26]发现外泌体LINC02418高表达,并可作为区分结直肠癌患者和健康志愿者的生物标志物(AUC=0.897 8,95%CI=0.864 4～0.935 1)。Li等[15]提出外泌体ADAMTS9-AS1可以作为结直肠癌的诊断生物标志物,该模型的AUC为0.835(95%CI=0.777～0.911)。Liang等[11]检测结直肠癌组织中及血浆外泌体lncRNA含量,发现结直肠癌患者组织lncRNA RPPH1表达显著上调,结直肠癌患者血浆外泌体RPPH1的诊断价值优于CEA和CA199标志物,且术后患者水平显著下降。Barbagallo等[27]发现,与健康对照相比,lncRNA UCA1在结直肠癌组织中上调,而在结直肠癌患者的血清外泌体中下调。UCA1水平区分结直肠癌患者与HC的敏感性和特异性分别为100%和43%。Wang等[6]发现结直肠癌患者血清外泌体中结肠癌相关转录物2(CCAT2)相比于健康对照显著过表达,这些外泌体lncRNAs可以作为结直肠癌的诊断标志物。同时,Hu等[7]发现显示相比于健康对照,结直肠癌患者的外泌体LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602表达显著升高,这些外泌体lncRNAs均可作为结直肠癌患者的潜在非侵袭性生物标志物用于结直肠癌的早期诊断。Oehme等[28]发现外泌体lncRNA HOTTIP低表达可有效识别结直肠癌患者,且可以作为术前风险分层的有价值的替代生物标志物,HOTTIP低表达是总生存期较差的独立预后标志物。

在预测复发转移方面,相关研究较少。Zhang等[5]采用高通量lncRNA微阵列和qPCR基础筛选并构建了基于5-exosomal lncRNAs (exolncRNAs) panel的模型,对复发性结直肠癌患者显示出较高的区分能力,在预测结直肠癌复发方面优于血清CEA和CA19-9。外泌体lncRNAs在结直肠癌诊断及预后中的临床意义详见表1。

表1 外泌体lncRNAs作为诊断和预后标志物潜力Table 1 Potential of lncRNAs in exocrine as diagnostic and prognostic markers

3 中医药通过lncRNAs防治结直肠癌的作用研究现状

目前围绕外泌体lncRNAs开展的中医药防治结直肠癌的研究相对较少。Chen等[29]发现大黄蟅虫丸通过抑制外泌体lncRNA CCL2介导的M2转化,并改善促纤维化微环境,抑制结直肠癌肝转移。由于中医药作用于外泌体lncRNAs发挥防治结直肠癌作用的研究较少,为进一步了解其机制,笔者检索了中医药作用于结直肠癌细胞内lncRNAs的相关机制研究,发现多个中药单体和复方可通过调节lncRNA在防治结直肠癌中发挥重要作用。

3.1 中药单体

研究显示,姜黄素可通过上调结直肠癌细胞BRCA1 lncRNA 2(NBR2)抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成和S期细胞的百分比[30]。姜黄素还可降低lncRNA PANDAR表达,进一步上调PUMA表达并促进3种结肠癌细胞系(包括DLD-1、SW620和HCT116)的凋亡[31]。同时,姜黄素可有效下调lncRNA KCNQ1OT1的表达,抑制miR-497/Bcl-2轴,逆转结直肠癌细胞顺铂耐药性[32]。

Li等发现人参皂苷Rg3可负向调节lncRNA CCAT1,并下调PI3K/AKT信号通路,抑制结直肠癌细胞的生长、迁移和侵袭[33]。槐角提取物染料木素则可抑制结直肠癌细胞中lncRNA TTTY18/Akt通路促进细胞凋亡,并减少细胞迁移[34]。重楼皂苷Ⅶ可抑制HCT116细胞增殖,促进凋亡,抑制侵袭,其作用途径之一是改变细胞lncRNA表达[35]。白蔹素可调节lncRNA ZFPM2-AS1/miR-515-5p表达进而调控结直肠癌细胞的迁移和侵袭[36]。黄连素可通过上调结直肠癌细胞LncRNA CASC2从而抑制Bcl-2促进结直肠癌细胞凋亡[37]。银杏叶提取物EGb761通过上调lncRNA-P21表达,稳定E-钙黏蛋白,抑制结直肠癌细胞侵袭和转移[38]。三七总皂苷上调lncRNA SNHG6抑制结直肠癌细胞的活力,增强结直肠癌细胞的放疗敏感性[39]。

3.2 中药复方

罗吉等[40]发现具有益气健脾、化瘀解毒功效的健脾消癌方可能通过抑制SW620细胞TGF-β诱导的lncRNA-ATB表达,增加miR-200a的表达,降低ZEB1表达来抑制结肠癌的转移。焦蕉等[41]发现健脾消癌方可有效抑制结肠癌细胞转移,其机制可能与抑制lncRNA HOTAIR/JAK2/STAT3信号通路的表达相关。Zhang等[42]研究发现清解扶正颗粒显著抑制HCT-8和HCT116细胞的生长和转移,降低lncRNA ANRIL、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4和N-cadherin的表达,并上调HCT-8和HCT116细胞中let-7a的表达。Lu等[43]发现在体外实验中,健脾复方提取物以剂量依赖性方式下调lncRNA MALAT1表达,抑制人结直肠癌细胞的迁移和生长,减少肺转移的数量。

上述中药复方及单体或具有健脾、益气等扶助正气的功效,或具有清热、解毒、燥湿、活血、散瘀、消痈、散结等祛除邪气的功效,或扶正祛邪兼而有之。其通过影响lncRNAs发挥作用的机制包括抑制肿瘤细胞免疫逃逸,抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,改善肿瘤微环境,抑制EMT,增强化疗药敏感性等,其与外泌体lncRNAs的改变促进结直肠癌发生发展的机制相反,故我们推测,中医药通过外泌体lncRNAs发挥防治结直肠癌作用的机制可能是通过扶正祛邪实现的,其具体机制见表2。

4 中医药通过干预外泌体lncRNAs防治结直肠癌的作用机制思考

基于上述研究,我们推测外泌体lncRNA可能是中医药干预结直肠癌的重要靶点之一。结直肠癌属“肠覃”“肠风”“便血”“积聚”“肠僻”“下痢”“肠积”“锁肛痔”等范畴,历代医家对其治疗的认识不尽相同,孔宪斌等[44]认为结直肠癌基本病机为正气亏虚、气血瘀滞、毒邪旺盛,应从“虚、毒、瘀”角度进行辨证治疗。李维忠等[45]提出结直肠腺瘤分期辨治的观点,认为早期结直肠核心病机是脾气亏虚,湿痰瘀互结,治当健脾利湿、化痰祛瘀散结,重在消瘤散结;晚期结直肠腺瘤癌变的核心病机是脾气亏虚,湿痰瘀毒互结,治当健脾利湿，化痰祛瘀，抗癌解毒,重在抗癌解毒,防治腺瘤癌变。王俊壹等[46]认为结直肠癌癌前病变的基本病机为脾虚不健,湿浊瘀毒阻滞肠道;主要病理因素为癌毒、湿浊、瘀血;治疗以扶正祛邪为原则,以益气健脾为要,解毒化湿祛瘀并举。王晞星等[47]认为结直肠癌基本病机为脏腑功能失和、正气亏虚,邪毒下注于大肠,治疗当立足脏腑,以调和脾胃、调和肝脾、平调寒热阴阳、和解少阳与阳明之“和法”治疗。张钦畅等[48]认为湿热瘀毒,脾气亏虚是结直肠癌转移的基本病机,与转移前微环境形成密切相关。虽然现代医家对结直肠癌病机的认识有别,但总体认为其病机为本虚标实,本虚为正气亏虚,标实为湿、痰、瘀、毒互结。见表2。

表2 中医药通过lncRNAs防治结直肠癌的作用机制Table 2 The mechanism of prevention and treatment of colorectal cancer by traditional Chinese medicine through lncRNAs

4.1 扶正治癌

正气指人体内的元气,即人体的防御、抵抗和再生的功能,人体的免疫功能属于正气的范畴,唐振豪等[49]认为免疫逃逸是人体抗肿瘤功能下降,属于正虚范畴。外泌体lncRNAs通过诱导免疫逃逸损伤人体正气,加重正虚,从而导致结直肠癌病情持续进展[9-11]。陶智怡等[50]研究发现益气温阳方联合化疗能明显降低Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者外周血Treg细胞比率来调节肿瘤免疫逃逸微环境,抑制肿瘤生长转移。通过调节外泌体lncRNAs减少免疫逃逸抑制结直肠癌进展可能是中医药扶正治癌的作用机制之一,可作为中医药扶正治癌研究的思路和方向。

4.2 祛邪治癌

标实为各种病理因素交互为患,血管新生、细胞侵袭迁移和化疗耐药与标实之痰、湿、热、毒、瘀等病理因素密切相关,已有研究证实,中医药可以通过健脾清利湿热、活血化瘀改善结直肠癌的化疗耐药[51]及血管新生[52],具有解毒功效的中药可促进结直肠癌细胞凋亡,抑制细胞增殖、侵袭和迁移[53]。相关研究发现,多个中药单体及复方可以通过调节lncRNA发挥逆转结直肠癌耐药[32]、促进凋亡、抑制增殖、侵袭和迁移的作用[30-31,34-38,40,43],这些中药均具有清热燥湿、活血化瘀和解毒散结等功效。中医药通过调节外泌体lncRNAs发挥上述功效抑制结直肠癌进展可能是中医药祛邪治癌的作用机制之一。

由于目前对中药通过干预外泌体lncRNAs防治结直肠癌的研究较少,基于现有研究,笔者推测中药可能是通过调节外泌体lncRNAs水平,进而抑制结直肠癌细胞免疫逃逸,抑制结直肠癌细胞侵袭和迁移,抑制血管新生,增加结直肠癌细胞对放化疗敏感性、抑制EMT等发挥防治结直肠癌作用的。现有研究大多是对中药单体提取物作用于结直肠癌细胞内lncRNAs的机制研究,不能完全反映其通过外泌体发挥作用的机理。笔者认为在未来的研究中,应积极开展中药尤其是中药复方通过外泌体lncRNAs发挥防治结直肠癌作用的机制研究,以期进一步阐释中医药在表观遗传学上发挥作用的机制,这对中医药现代化以及探索构建中国特色的中西医结合肿瘤防治体系具有重要意义。