HS-SPME-GC-MS结合化学计量法分析刺五加不同部位的挥发性成分

何嘉伟,江汉美,黄振阳,曾格格,戴全武,刘天琪,韩蔓

(湖北中医药大学湖北省药用植物研发中心,湖北 武汉 430065)

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根茎或茎,性温,味辛、微苦,归脾、肾、心经[1],为东北地区道地药材,同时被收入国家卫健委颁布的药食同源目录中,可作为保健食品的原料使用[2]。刺五加具有益气健脾,补肾安神,强健筋骨的功效,现代药理研究表明其具有抗肿瘤、抗疲劳、保肝、降血糖等药理作用[3-4]。随着人们对刺五加的药效和应用研究深入,其已被开发为多种药品及保健品[5]。

2020年版《中国药典》将刺五加的根和根茎或茎收录其中[1],但其非常规药用部位如皮、叶、果也皆可入药,且被证实具有多种药理作用:刺五加皮、果具有抗癌、抗衰老、抗炎等作用,叶具有安神、降低血糖等作用[6-8]。目前对刺五加的研究多集中在其根部及多糖类、苷类(如紫丁香苷)、黄酮类等成分[9],对其挥发性成分的研究较少,皮、叶、果等非常规药用部位还需进一步地研究及开发利用。将刺五加不同部位中挥发性成分进行系统性地检测及比较分析,对拓展刺五加的药用部位及全面评价刺五加的药效和保健作用具有重要意义。

顶空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)技术操作简单、费用低廉且减少了煎煮过程中造成的挥发性成分流失,能较真实地反映样品中挥发性成分组成,现已应用于食品、医药等多个领域[10]。因此,本研究采用HS-SPME-GC-MS法,对刺五加不同部位的挥发性成分进行测定,通过主成分分析(Principal component analysis,PCA)和聚类分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)进行比较,分析研究不同部位间挥发性成分的差异,为刺五加资源的深入开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

刺五加药材(批号:20200302)购于百色市生物药品有限公司,经湖北中医药大学杨红兵教授鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms。后经加工分别得到刺五加不同药用部位:根(AS-R)、皮(AS-V)、茎(AS-S)、叶(AS-L)、果(AS-F)。

1.2 仪器

C-MAG HS-4型手动固相微萃取进样装置,德国IKA公司;ThermoFisher Trace 1310型气相质谱联用仪,美国ThermoFisher公司;TG-1701 MS毛细管柱;顶空瓶(15 mL);65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取纤维头,美国Supelco公司;ALC-210.2型电子天平,北京赛多利斯天平有限公司。

1.3 样品制备

将刺五加各部位样品分别用粉碎机打成粉末并过16目筛,取出备用。

1.4 分析方法

1.4.1 GC条件 色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气:高纯度氦气(99.999%);流速:0.8 mL·min-1;进样口温度:230 ℃;程序升温:从50 ℃开始,以10 ℃·min-1升温至230 ℃。

1.4.2 MS条件 EI源;离子源温度230 ℃,电离电压70 eV;四极杆温度150 ℃;扫描质量范围m/z40～600。

1.5 HS-SPME条件的优化

1.5.1 取样量的优化 精密称取刺五加根粗粉0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g,在60 ℃下平衡10 min,选用65 μm PDMS/DVB萃取纤维头萃取15 min,按“1.4”项下条件进样测定,以色谱出峰总面积为主要指标,以质谱鉴定出的化合物种类数为辅助指标,对样品取样量进行优化。

1.5.2 萃取温度的优化 精密称取刺五加根粗粉0.8 g,其他条件不变,分别在40、60、80、100、120 ℃条件下对混合样品进行萃取,按“1.4”项下条件进样测定和分析。

1.5.3 萃取时间的优化 精密称取刺五加根粗粉0.8 g,在100 ℃下加热平衡10 min,其他条件不变,选用65 μm PDMS/DVB萃取纤维头分别萃取10、15、20、25、30 min,按“1.4”项下条件进样测定和分析。

1.5.4 解析时间的优化 精密称取刺五加根粗粉0.8 g,在100 ℃下加热平衡10 min,选用65 μm PDMS/DVB萃取纤维头萃取15 min,取出,立即插入色谱仪进样口,分别解析1、2、3、4、5 min,按“1.4”项下条件进样测定和分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对刺五加各部位的挥发性成分及其含量进行PCA及HCA。

2 结果

2.1 HS-SPME条件优化结果

考察结果见图1,当取样量为0.8 g、萃取温度为100 ℃、萃取时间为15 min、解析时间为3 min时分别有最佳的吸附效果。最终确定HS-SPME最佳条件为:精密称取刺五加根粗粉0.8 g,置于15 mL顶空瓶中,插入装有65 μm PDMS/DVB萃取纤维头的手动进样器,在100 ℃下加热平衡10 min,再压缩手柄伸出萃取头萃取15 min,取出,立即插入气相色谱仪进样口解析3 min。刺五加其他4个部位的实验条件同上。

图1 各因素对刺五加挥发性成分萃取效果的影响Fig.1 Effect of various factors on the extraction effect of volatile components of Acanthopanax senticosus

2.2 刺五加不同部位的挥发性成分分析

采用HS-SPME-GC-MS法对刺五加各部位样品挥发性成分进行检测分析,用峰面积归一化法从各总离子流图中计算各组分相对含量,利用 NIST.14标准谱库检索色谱图中存在的可能化合物,结合相关文献进行人工谱图解析,并结合相对保留时间,初步鉴定出了78 种化合物,化学成分分析结果见表1,刺五加不同部位挥发性成分的总离子流图见图2。

表1 刺五加不同部位的挥发性成分及相对含量Table 1 Volatile components and relative contents in different parts of Acanthopanax senticosus

(续表一)

(续表二)

(续表三)

注:A.根;B.皮;C.茎;D.叶;E.果图2 刺五加不同部位挥发性成分总离子流图Fig.2 Total ion flow diagram of volatile components in different parts of Acanthopanax senticosu

由表1及图2中可知,从刺五加5个部位中共鉴定出挥发性成分167种。其中从根中分离出76个峰,并鉴定出71种成分;从皮中分离出70个峰,并鉴定出61种成分;从茎中分离出70个峰,并鉴定出59种成分;从叶中分离出59个峰,并鉴定出48种成分;从果中分离出63个峰,并鉴定出54种成分。各部位所鉴定出的成分总量分别占总挥发性成分的97.34%、96.31%、93.67%、95.99%、96.01%。

表1中的挥发性成分可分为烷类、烯类、醇类、酮类、芳香族类等化合物,刺五加各部位挥发性成分组成存在差异(表2、图3),烯类、醇类、芳香族类化合物是5个部位主要的主要成分;皮、茎、叶、果中烯类和醇类化合物相对含量总和(79.59%、76.20%、75.45%、81.93%)显著高于根(31.5%);根中芳香族类化合物相对含量(24.73%)要显著高于其他4个部位，且以茴香脑为主(21.08%);同时根和果中醚类、有机酸类化合物相对含量之和(11.91%、6.25%)要高于其他3个部位;另外皮、茎、叶中检测出部分氧化物类化合物(7.78%、2.63%、1.57%)。

表2 刺五加不同部位挥发性成分的种类及相对含量(%)Table 2 Types and relative contents of volatile components in different parts of Acanthopanax senticosus(%)

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.茎;AS-L.叶;AS-F.果图3 刺五加不同部位挥发性成分种类差异图Fig.3 Differences in the types of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

2.3 刺五加不同部位的挥发性成分中共有成分和特有成分分析

刺五加根、皮、茎、叶、果中共有的挥发性成分有10种(图4),包括萜品油烯、萜品烯、4-烯丙基苯甲醚、(-)-α-蒎烯、β-石竹烯、E-β-合金欢烯、α-律草烯、β-杜松烯、桉油烯醇、石竹素。其不同部位共有成分的相对含量存在较大差异,其中β-石竹烯在各部位中含量都较高;果中萜品油烯(8.13%)、E-β-金合欢烯(13.74%)含量均高于其他4个部位;茎中β-杜松烯(9.57%)含量显著高于其他部位;皮和叶中桉油烯醇(6.03%、5.81%)含量高于其他3个部位。

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.茎;AS-L.叶;AS-F.果图4 刺五加不同部位挥发性成分Venn图Fig.4 Venn map of volatile components in differentparts of Acanthopanax senticosus

刺五加根中特有成分有45种,占其挥发性成分总量的57.16%,主要以酯类与芳香族化合物为主,包括E-藁本内酯(2.39%)、川芎内酯(1%)、茴香脑(21.08%)等。刺五加皮中特有成分有21种,占其挥发性成分总量的16.54%,包括红没药醇氧化物(7.62%)、(-)-愈创醇(1.56%)等。刺五加茎中特有成分有13种,占其挥发性成分总量的5.99%,包括正十四烷(1.08%)、T-杜松醇(0.69%)等。刺五加叶中特有成分有10种,占其挥发性成分总量的5.48%,主要以酮类化合物为主(4.09%),包括胡椒酮(1.63%)、β-紫罗兰酮(1.05%)等。刺五加果中特有成分有14种,占其挥发性成分总量的9.57%,主要特有成分有(+)-香橙烯(2.01%)、反式-α-香柑油烯(0.83%)等。

2.4 刺五加不同部位的挥发性成分HCA

通过SPSS 21.0统计软件对刺五加不同部位的10种共有成分的相对含量进行HCA,采用Complete聚类法,以Euclidean距离为测度。绘制刺五加不同部位挥发性成分聚类热图,颜色的深浅代表各部位成分相对含量的高低,颜色越深,相对含量越高[11]。如图5所示,刺五加的根与果聚为一类;皮和叶聚为一类,再与茎聚为一类。HCA结果说明刺五加根和果共有成分的种类和含量具有一定的相似度,与皮、叶和茎之间差异较大。

注:AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.茎;AS-L.叶;AS-F.果图5 刺五加不同部位挥发性成分聚类热图Fig.5 Cluster heat map of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

2.5 刺五加不同部位的挥发性成分PCA

为了便于对刺五加5个部位间挥发性成分的相似性和差异性进行科学准确的评价,利用PCA对表1中的数据进一步分析。通过SPSS 21.0统计软件对5组样品的167种挥发性成分及其含量进行PCA。经分析后,共提取5个主成分(表3),其中前2个主成分的特征值均>1,其方差贡献率分别为50.04%、20.06%,2个主成分累计贡献率达到了70.10%,故选取主成分一、二能够反映样品的整体信息。

表3 主成分的特征值及其贡献率Table 3 The eigenvalues of principal componentsand their contribution rates

各特征向量挥发性成分相对含量数据再通过SPSS 21.0统计软件标准化后,得到各部位的因子得分、主成分得分和综合得分(表4)。由主成分综合得分(Y)可知,刺五加不同部位挥发性得分存在显著差异,其中刺五加根挥发性成分的综合得分最高(1.25),其次为茎(-0.22)、果(-0.67)、叶(-0.87)、皮(-1.09)。

表4 刺五加不同部位挥发性成分因子得分、主成分得分和综合得分Table 4 Factor scores, principal component scoresand composite scores of volatile componentsin different parts of Acanthopanax senticosus

分别以主成分一、二做PCA散点图(图6),通过分析各点之间的距离来判断刺五加各部位挥发性成分的差异程度。由图6可知,刺五加不同部位处于各自独立的空间,表明刺五加各部位挥发性成分有显著差异,与表4中综合得分相对应。此外皮、叶和茎的距离较近,根和果均位于第一象限,进一步证实了HCA的分析结果。

注: AS-R.根;AS-V.皮;AS-S.茎;AS-L.叶;AS-F.果图6 刺五加不同部位挥发性成分PCA散点图Fig.6 PCA scatter plot of volatile components indifferent parts of Acanthopanax senticosus

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS联用技术从刺五加的根、皮、茎、叶、果中共鉴定出167种挥发性成分,各部位挥发性成分的种类和含量差异较大,其中烯类、醇类、芳香族类化合物占比较大。5个部位共有成分仅10种,其中含量较高的β-石竹烯具有抗炎抑菌、保护神经的作用[12];α-律草烯具有抗炎、抗病毒的药理作用[13];同时β-石竹烯和α-律草烯在皮、叶、果中的含量高于根及茎,因此刺五加的非药用部位可作为抗炎类药物进一步研究。从刺五加各部位主要挥发性成分看,根中主要挥发性成分茴香脑能缓解胃肠平滑肌痉挛,改善胃肠功能紊乱,还有脑保护和减轻脑水肿、镇痛抗炎等作用[14-15];茎中含量较高的桉油烯醇可起到平喘祛痰、抗菌的作用[16];叶的主要挥发性成分薄荷脑具有镇痛、利胆及安神醒脑的作用[17-18];皮、叶、果中含量较高的芳樟醇具有抗焦虑、抗肿瘤、镇静催眠等作用,在医药、食品等领域广泛使用[19],因此刺五加还可作为改善睡眠的茶叶或饮品的原材料,可开发为功能性保健食品。

PCA和HCA分析结果能更直观地反映出刺五加不同部位之间挥发性成分及含量的差异。结合综合得分与PCA散点图来看,刺五加药用部位得分均高于非常规药用部分,根的得分最高,其次为茎、果、叶、皮。HCA结果显示根和果共有成分的种类和含量具有一定的相似度;皮、叶与茎共有成分的种类和含量具有一定的相似度,表明刺五加非常规药用部位具有开发应用的潜力。

目前对刺五加其他非药用部位的研究仍较少,其皮、叶、果未得到充分的开发利用,但这些部位具有丰富的药效成分及众多药理作用。因此,本实验首次运用HS-SPME-GC-MS联用技术测定分析刺五加不同部位的挥发性成分,阐明其不同部位的关键成分及不同部位间挥发性成分的差异,为进一步开发利用刺五加资源提供科学依据。