猪伪狂犬病检测技术研究进展

陈云蕾，吴 兰，丁林玲，张泽林，程国华，王佳璟，张 鲲

（ 1． 桐庐县无规定马属动物疫病区管理中心，浙江 杭州 310000 ；2． 桐庐县农业农村局，浙江 杭州 310000 ； 3． 浙江康嘉基因技术有限公司，浙江 杭州 310000 ）

猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）又称Aujeszky 氏病，是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）感染引起的以发热、腹泻、繁殖障碍和呼吸系统症状为主的急性接触性传染病。PRV的天然宿主是猪，还可感染牛、犬、猫等多种家畜和野生动物，对世界畜牧业造成了严重的经济损失[1-3]。研究发现，PRV 可跨越物种屏障并诱发人脑膜炎，但对人PRV脑膜炎的明确仍存在争议[4]。PRV的传播途径包括接触传播、垂直传播以及空气传播等，其中空气传播最早可追溯至1813年，但其具体机制及传播能力尚不明确[5]。自1947 年我国首次报道猪感染PRV 以来[6]，随后也出现了牛、山羊等多种动物感染PRV的报道，直到1970年Bartha-K61疫苗株引入我国后，PR才得以很好的控制[7]。2011年底，部分免疫Bartha-K61疫苗株的猪场出现了以神经系统疾病和仔猪高死亡率为特征的PRV 突变株[8-10]，并迅速蔓延至中国大部分地区，严重影响了我国养猪业的发展，也对PR 疫情防控提出了新的检测需求，特别是在如何区分疫苗株与野毒株感染、隐性感染的鉴定、免疫保护水平评价等方面。新型检测技术方法的出现为PR防控提供了更多选择，但如何筛选有效的检测方法对于PR 防控具有重要的意义。本文就PRV 蛋白结构特点、临床症状、血清学诊断技术及核酸检测技术展开叙述，阐述近年PRV新型检测技术的灵敏度及各检测方法临床应用中的优缺点，以期为临床PRV净化、防控过程检测方法的选择提供参考。

1 PRV流行特点

PRV 属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科，与牛疱疹病毒Ⅰ型和马疱疹病毒Ⅰ型具有较高的同源性[11]。PRV 为线状双股DNA，基因组大小为143 kb，具有典型疱疹病毒特征，病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜，直径约为150～180 nm，由含病毒基因组的核蛋白核心、病毒的多面体核衣壳、蛋白衣壳和含有病毒编码糖蛋白细胞膜的脂质双层膜组成[12-13]；其中病毒多面体核壳皮呈二十面体结构包裹病毒DNA，具有保护病毒DNA的作用。迄今为止，已鉴定到的PRV基因有72种，主要是一些病毒复制相关的酶、结合点蛋白、转录因子以及相关结构蛋白和毒力蛋白等[14]。PRV 的毒力是由编码胸腺激酶（TK）及糖蛋白gE、gI 和核苷酸还原酶（RR）等多种基因协同控制[15-17]；其中TK 基因作为主要的毒力基因，若发生失活，宿主的毒力将降低或丧失。现有的PRV 缺失疫苗株均是针对TK、gE、gI 和RR等毒力基因的缺失对机体产生保护作用[18-19]，也成为临床通过检测缺失疫苗株蛋白的抗体区分疫苗免疫和野毒感染动物的关键。

多种动物均可感染PRV，如反刍动物、啮齿动物和食肉动物，病死率可达到100%[20-21]。猪是PRV的储存宿主，感染后潜伏期一般为3～6 d，临床症状随年龄、感染毒株的毒力及免疫效果的不同而表现出很大差异[22-23]。PR 常以轻微或隐性感染为主，表现为一过性发热、便秘等症状，多在3～4 d恢复，若继续发展则会出现神经症状，偶尔也可引起死亡。妊娠母猪感染PRV 后，常经垂直传播感染胎儿，其发病率和病死率随着日龄增长而逐渐降低，断乳仔猪可长期带毒、排毒[24]。感染种猪和仔猪长期带毒是本病长期流行和难以根除的关键。饲养管理不善、卫生条件差、其他疫病控制不力、各种应激均可诱发PR，且PR 无严格的季节性，以寒冷季节多发[11]。此外，由于PRV 本身具有很强的免疫逃逸能力，不仅猪体内能够持续感染，破坏免疫系统，还可诱发其他疾病的产生，给养殖户带来极大的损失。目前尚无针对PRV有效的药物，只能通过疫苗接种进行预防和高免血清治疗降低病死率，因此高效灵敏的PRV检测方法是临床中PR防控和健康养殖的有效支撑。

2 PRV检测技术

PR的检测技术、诊断准确率是预防PRV的先决条件，早发现早防控方可有效降低养猪业的经济损失，目前临床PRV的常用诊断技术以血清学诊断和核酸诊断为主。

2.1 血清学检测技术

2.1.1 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA是应用最广泛的血清抗体检测方法，与其他方法相比因具有更高的灵敏度和更简单的特性而备受关注。而选择抗体或抗原的不同则具有不同的检测意义，以PRV gE 缺失疫苗建立的ELISA 诊断方法，可快速有效地鉴别PRV 野毒感染抗体和免疫gE 基因缺失疫苗而产生的抗体，对野毒的发现具有重要意义[25]；gB蛋白作为PRV的一种必须糖蛋白和重要免疫原，所诱导产生的中和抗体水平可以反映猪群的免疫状态，因此，选择gB 蛋白建立的ELISA方法可有效评估疫苗的免疫效果。

刘旻翾等[26]针对PRV gB糖蛋白高度保守的抗原优势肽段设计的间接ELISA 方法，仅对PRV 血清检测阳性，与其他病毒阳性血清均无反应阳性；最低检测下限血清稀释度为1∶128，高于IDEXX PRV/ADV gB 抗体检测试剂盒下限稀释度（1∶4），批内、批间重复变异系数小于10%，可有效区分疫苗免疫和野毒感染。张洪亮等[27]利用Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区建立了一种PRV抗体间接ELISA检测方法，仅与阳性血清反应，敏感性可达1:1 600，批内、批间重复变异系数小于10%。赵静[28]依据制备和筛选的gB 单克隆抗体（mAb）312H 为阻断抗体建立的阻断ELISA 检测方法，与猪圆环病毒2 型（PCV2）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）-1 DV株、PRRSV-2 F112株血清均无交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%，对PRV 变异株二倍梯度稀释（1∶2～1∶2 048）阳性血清，比IDEXX 试剂盒敏感性高2～8 倍。PRV 变异株对gB 不同表位的抗原漂移影响和个体对不同表位的变异多样化，阻断ELISA会出现一定的误判[29]，与间接ELISA相比仍需进一步优化和改进；其高灵敏度和更简单的特性仍是鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体的首选，为PRV的防控和净化工作提供检测依据。

2.1.2 胶体金免疫层析技术（GICA）

GICA是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型免疫检测技术，检测不依赖仪器设备，具有可直接判读结果、操作简单、敏感性高、特异性强等优点，特别适合基层兽医使用[30]。王华俊等[31]利用胶体金标记纯化的抗PRVgB单克隆抗体10D4组装成侧向层析（LFA）方法通用胶体金层析试纸，检测下限为1∶640、TCID50为1×108.6/0.1 mL的灭活抗原，与CSFV、PRRSV、PCV2、猪细小病毒（PPV）、PEDV 均无交叉反应。雷有玲等[27]以重组gE 蛋白和猪IgG 组装胶体金PRV gE 抗体免疫层析试纸；最低检出1∶1 280 倍稀释样品，与IDEXX gE-ELISA 抗体试剂盒符合率为95.31%。郭力伟等[32]以重组gE蛋白为免疫原，5D10 和6E8 为标记抗体和检测抗体组装检测PRV野毒株的胶体金免疫层析试纸条，与CSFV、PRRSV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、PPV、PCV-2和PRV疫苗株均无交叉反应，且野毒株检出量可达1×102.83TCID50，与PCR方法的符合率达92.59%。以gE、gB 等抗体组装胶体金试纸条，操作简便、灵敏度较高、不依赖设备仪器，更适合基层养殖单位进行PRV野毒的快速鉴别诊断。

2.1.3 荧光微球免疫检测技术（FMIA）

FMIA是一种结合荧光微球作为抗原复合物结合抗体的蛋白质检测方法，适用于单一复杂样品中不同分析物的高通量、多重和同时检测，检测快速，具有较好的准确性和重复性。有研究[33-34]将PRV gE、gB 重组蛋白作为抗原分别与12号、28号磁珠微球偶联，用gE-12、gB-28偶联复合体作为捕获载体，分别建立了gE、gB IgG 抗体FMIA 检测方法，在此基础上建立了PRV gE 和gB IgG 抗体的双重荧光微球免疫学检测方法。经ROC 曲线分析显示，gE 临界值为5 991.5 时，AUC 最大为0.981，敏感度为92.3%，特异性为99.26%；gB 临界值为2 862 时，AUC 最大为0.989，敏感度为96.3%，特异性为95.74%；此方法具有重复性好、灵敏度高、特异性好等特点。这种方法的建立可应用于PRV野毒感染猪和疫苗免疫猪的快速鉴别诊断及保护性抗体的检测，是一种多重抗体检测的重要方法，为动物疫病多重抗体的检测诊断提供了思路，值得大面积推广。

2.1.4 竞争化学发光酶联免疫法（CLEIA）

CLEIA是酶联免疫分析技术与化学发光技术的结合，通过化学发光强度与反应物浓度的正比关系，检测微量抗原或抗体的一种新型免疫测定技术[35]；比间接ELISA方法需求时间短、操作简单，可定量分析[36]。马震原等[36]以PRV gB蛋白组建了可快速检测的一种竞争化学发光酶联免疫抗体检测方法，最低可检测1∶2 048 稀释的国家参考血清，与CSFV、PRRSV、PCV2 等标准阳性血清无交叉反应；与中和试验阳性符合率为94%，阴性符合率为96.92%，明显优于商品化ELISA 试剂盒，为PRV gB 抗体的快速定量检测提供了一个科学可靠的技术手段。此方法快捷、敏感、高效，能够较好地在动物疫病防控一线中推广与应用。

2.2 核酸检测技术

2.2.1 聚合酶链式反应（PCR）

PCR 由变性、退火、延伸等3个基本反应步骤构成，其特异性主要依赖与靶基因序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR一般应用于检测血液、血清或器官样品中的基因组序列，具有检测速度快、操作简单、取样少、特异性强等优点，但PCR 检测时需注意的是3 周内未接种过伪狂犬弱毒疫苗的猪，以免造成误诊。胡铭哲等[37]利用PRV全基因组筛选出的基因片段建立了一种鉴定Ⅰ型和Ⅱ型PRV 基因型的PCR 分型方法，检测CSFV、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、PRRSV、PEDV 和猪圆环病毒3 型（PCV3）时均为阴性，两种分型方法针对Ⅰ型和Ⅱ型PRV的最低检测限均为1×104copies/μL。该方法特异性强、灵敏度高，单重和双重PCR 检测结果一致。赵宇等[38]根据GenBank 中公布的PRV gE 基因和PCV3 基因组序列的保守区域设计并建立了一种能够同时检测PRV 和PCV3 的双重PCR 检测方法，对PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、PEDV 无反应，PRV最低检测值为502.0 copies/μL，PCV3 最低检测值为91.2 copies/μL。结果表明，该方法可快速检测PRV 和PCV3，具有很好的特异性和灵敏度，为PRV 流行病学调查、感染猪群的清群净化提供了有效技术手段。

2.2.2 实时荧光定量PCR（qPCR）

qPCR是将扩增过程中实时收集的荧光基因信号使用标准曲线对未知模板的定量分析。与常规PCR 方法比较更快速、灵敏、不易交叉污染，可进行定量分析，是病原学诊断中常用的方法。常晨等[39]根据PRV gI/gE基因序列建立一种鉴别PRV 野毒株的qPCR 方法，灵敏度达到102copies/μL，具有较好的特异性和重复性，经动物试验验证qPCR 比普通PCR 能够更灵敏地检出多种组织的带毒量。温书香等[40]利用PRV gE基因构建了一种qPCR方法，可快速、特异地鉴别野毒株与疫苗株，检测灵敏度可达10 copies/μL，与CSFV、PRRSV、PPV、PCV 不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性，且与两种商品化试剂盒验证结果一致。此检测方法可应用于日常PRV 野毒株与疫苗免疫株的鉴别诊断，为PRV的净化提供技术支撑。

2.2.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP是由Notomi[41]利用识别靶序列上的8个特异区域和Bst DNA 聚合酶在恒温下形成瀑布式的核酸高效扩增，具有操作方便、反应迅速、成本低廉和结果可视等优点，目前被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等病原体的检测[42-43]。许宗丽等[43]利用PRV gB 基因的保守序列建立了一种在常规65 ℃水浴锅中30 min内通过肉眼观察颜色直接判定结果的LAMP 可视化检测方法，与CSFV、PCV2 等均无反应，敏感性可达1 fg，与普通PCR 检测结果一致。陈珍金等[44]基于LAMP引入PRV gB基因序列保守区段设计筛选出的引物建立了一种LAMP 检测方法，与CSFV、PCV2、PRRSV等8种病原无反应，敏感性可达10 fg/μL，稳定性强，与qPCR结果高度一致，且操作简单、便捷，此方法的建立为PRV 的快速检测和基层检疫提供了新的选择。部分LAMP检测方法的研究见表1。

2.2.4 重组聚合酶扩增（RPA）

RPA 是一种等温DNA 扩增技术[45]，重组酶和引物形成蛋白-DNA混合物并启动寻找模板DNA上的同源序列；已广泛应用于多种病原微生物的快速检测，也是一种适用于现场检测的方法[46-48]。刘立兵等[49]根据PRV gB和gE基因保守区域设计引物，建立了一种在38 ℃恒温反应20 min 可实现对PRV 野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测的双重RPA 方法，最低检测限均为102copies/μL，与荧光定量PCR 检测限一致，且检测结果符合率100%。这种方法建立的PRV双重RPA方法特异性强，敏感性高，对仪器设备要求低，操作简单，反应快速，对于我国猪群中国PRV的流行病学调查和防控具有重要意义。

2.2.5 DNA芯片

DNA芯片技术是一种大规模集成的固相杂交新技术，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或DNA探针按一定序列固化于基片上的DNA阵列。寡核苷酸微阵列亦是DNA 芯片的一种。吴凤笋等[50]利用PRV gE 基因设计、构建DNA芯片，通过对探针质量浓度、杂交温度和杂交时间的筛选和优化实现1×10-6ng 级灵敏度，高出普通PCR 灵敏度10 倍。罗宁等[51]利用PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV 等10 种病毒基因的靶基因点和具有Cy3 标记的荧光标记探针制作基因芯片，并经1 006份样品符合检测，最低检测浓度可达105copies/μL，与普通PCR/RT-PCR 相比，符合率96.79%以上；该研究结果为临床开展多病原联合检测技术提供了思路。DNA 芯片技术特异性强、灵敏度高，是动物疫病诊断技术的研究热点。

3 结论

PRV 变异株导致Barthk 61 疫苗株免疫后感染出现以神经系统疾病和仔猪高死亡率为特征的PR 暴发以来，疫苗免疫效果存在缺陷，且药物治疗效果不佳，使PR的防控愈加困难；只有充分了解现有PRV检测诊断技术的灵敏度及临床中各检测方法的优缺点，才能更好地对PR 进行净化。同时，PR的监测和净化也具有重要的公共卫生意义。自首次报道以来，基于临床症状、动物接触史或血清抗体检测结果的相关研究较多见，偶见有人类感染PRV 的报道。因此，PR 的监测与净化不但有利于提高养猪行业的经济效益，也会大大降低人感染PRV的风险。